摘 要：
目的 探讨黄芪注射液联合葛根素注射液通过缓解内质网应激(ERS)、抑制心肌细胞凋亡,改善2型糖尿病(T2DM)动物KKAy小鼠心脏损害,防治糖尿病心肌病的机制。方法 11周龄的KKAy糖尿病模型小鼠按血糖随机分为模型组和黄芪葛根组(黄芪注射液3 mL/kg联合葛根素注射液1.3 mL/kg进行治疗),同周龄雄性C57BL/6J小鼠作为正常对照组,适应性饲养1周后,于12周龄开始实验干预,在20、24和28周龄分批处理小鼠。电镜观察心肌形态改变, RT-PCR及Western Blot检测心脏组织葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous Protein, CHOP)、p53凋亡上调基因(p53 up-regulate modulator of apoptosis, PUMA)基因和蛋白的表达。结果透射电镜显示,模型组小鼠心肌细胞细胞核、内质网和线粒体肿胀,黄芪葛根组较模型组情况显著改善;RT-PCR和Western Blot结果显示,与正常组相比,3个周龄段模型组GRP78的基因和蛋白表达水平均明显升高,黄芪葛根组GRP78的基因和蛋白表达较模型组均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。CHOP和PUMA的基因和蛋白表达,3个周龄段模型组较正常组均增加(P<0.05),24、28周龄黄芪葛根组较模型组均下降((P<0.05)。结论 黄芪注射液与葛根素注射液联用对糖尿病小鼠心肌细胞超微结构具有保护作用,可缓解内质网应激,抑制心肌细胞凋亡,这可能是其防治糖尿病心肌病的机制之一。
关键词：
KKAy小鼠 黄芪注射液 葛根素注射液 糖尿病心肌病 细胞凋亡
Effects of astragalus and puerarin on the expression of GRP78,CHOP and PUMA in heart tissues of KKAy mice
Che Yu'e Gao Yushan Wang Yanfei Zhang Xiaofeng Fu Liang Li Shuyu Feng Jing Wu Dan Shi Changhua Li Xia Wang Qian
Beijing University of Chinese Medicine;
Abstract：
Objective To investigate the mechanism of astragalus injection combined with puerarin injection in improving the cardiac function of type 2 diabetic(T2 DM) KKAy mice by alleviating endoplasmic reticulum stress(ERS) and inhibiting cardiomyocyte apoptosis. Methods 11-week-old KKAy diabetes model male mice were randomly divided into model group and astragalas and puerarin group(astragalus injection 3 mL/kg combined with puerarin injection 1.3 mL/kg) according to their blood sugar. Male C57 BL/6 J mice of the same age were used as the normal control group. After one week of adaptive feeding, experimental intervention was started at 12 weeks of age, and mice were processed in batches at 20, 24 and 28 weeks of age. The morphological changes of myocardium were observed under electron microscope. RT PCR and Western Blot were used to detect the gene and protein expressions of glucose-regulated protein 78(GRP78), C/EBP homologous protein(CHOP), and p53 up-regulate modulator of apoptosis(PUMA) in heart tissue. Results Transmission electron microscopy showed that the nuclei, endoplasmic reticulum and mitochondria of the model group were swollen; compared with that, those in the astragalus and puerarin group were significantly better. The results of Real-time PCR and Western Blot showed that compared with the normal group, the GRP78 gene and protein expression levels of the 20-, 24-and 28-week-old mice in the model group were significantly higher, and the gene and protein expression of GRP78 in the astragalus and puerarin group were significantly lower than that of the model group(P<0.05). The gene and protein expressions of CHOP and PUMA were increased in the 20-, 24-and 28-week-old mice in the model group, compared with the normal group(P<0.05), and they were both lower in the 24-week-old and 28-week-old astragalus and puerarin groups compared with the model group(P<0.05). Conclusion Astragalus injection combined with puerarin injection seems to have a protective effect on the ultrastructure of diabetic cardiomyocytes. The way it works may be related to alleviating endoplasmic reticulum stress and inhibiting cardiomyocyte apoptosis.
Keyword：
KKAy mice; astragalus injection; puerarin injection; diabetic cardiomyopathy; apoptosis;
糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者心脏所发生的微血管病变,是指有明确糖尿病病史,同时有明确的心肌结构和功能的改变,排除缺血性疾病、高血压及其他可能引起心肌病变的疾病[1]。DCM发病机制复杂,与心肌代谢障碍、氧化应激和炎症反应等密切相关[2],其中心肌细胞凋亡增加在DCM 发展过程中具有重要作用,在糖尿病患者和动物模型中均可观察到这一情况[3]。有研究表明,通过抑制过强的内质网应激可缓解DCM中心肌细胞凋亡的现象[4],提示调控内质网应激水平可能是治疗DCM的有效策略。黄芪与葛根作为益气养阴的常用药对,对糖尿病及其并发症均有良好的疗效[5-6]。本研究用黄芪注射液联合葛根素注射液进行干预,探讨其对DCM小鼠心肌细胞凋亡和内质网应激途径的影响,进而为该药以及其他中医经典方药治疗糖尿病心肌病提供借鉴。
1 材料
1.1 实验动物
11周龄SPF级雄性KKAy小鼠和C57BL /6J健康小鼠,体重22～25 g,购自中国医学科学院实验动物研究所,动物合格证号: SCXK(京) 2013-0002,适应性饲养7 d,自由饮水和进食。高脂饲料(10%猪油+20%蔗糖+2.5% 胆固醇+0.5%胆酸钠+67%基础饲料) 购自北京科澳协力饲料有限公司,普通饲料购自中国医学科学院动物中心。
1.2 伦理审查
实验已经通过北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会审查,审查批号:BUCM-4-200160412-2001。
1.3 主要药物与试剂
黄芪注射液,国药准字:Z51021776,批号: 1009056,成都地奥九泓制药厂;葛根素注射液,国药准字:H20057609,批号: 1404163,湖南五洲通药业有限责任公司。
Trizol试剂(Sigma公司);mRNA反转录试剂盒、Power Sybrgreen(Promega 生物技术有限公司);蛋白裂解液、电泳液、电转液、TBS缓冲液(北京索莱宝科技有限公司);TEMED、Tween-20(北京普利莱基因技术有限公司);GRP78抗体、CHOP抗体、PUMA抗体(Abcam 公司);二抗(Cell Signaling Technology公司);包埋机、超薄切片机(德国徕卡公司);投射电子显微镜(日本JEOL公司);PCR扩增仪、BIO-rad基础电泳仪(伯乐生命医学产品有限公司);Step-OnePlus荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher Scientific公司);Universal HoodⅡ型凝胶成像仪(美国BIO-RAD公司)。
2 方法
2.1 分组、造模及给药
本实验分为正常组、模型组以及黄芪葛根组,每组18只。模型组和黄芪葛根组为11周龄的雄性KKAy小鼠,正常组为同周龄雄性C57BL/6J小鼠,正常组普通饲料喂养,KKAy小鼠用高脂饲料喂养,以上各组动物均为单笼饲养,自由饮食饮水,每日更换垫料。待12周龄时,将随机血糖≥13. 9 mmol /L 的KKAy小鼠视为造模成功,后续一直用高脂饲料维持饲养。正常组与模型组每日腹腔注射生理盐水(4.3 mL/kg)。黄芪葛根组每日先后注射黄芪注射液(3 mL/kg)和葛根素注射液(1.3 mL/kg)两种药物。
2.2 心肌组织样品采集和制备
于20、24、28周龄时分批处死各组小鼠,每组6只/次,使用DEPC预处理的手术器械,快速打开小鼠胸腔,将心脏剪下,预冷生理盐水冲洗残留血液,去除大血管,快速切留心尖组织,保存于液氮罐中备用。
2.3 病理形态学检测
从心尖处取下约1 mm3大小的组织块,放入2.5%戊二醛(pH7.4)中固定,制作超薄切片,电镜下观察超微结构。
2.4 RT-PCR检测mRNA表达
Trizol法提取心肌组织总RNA,使其纯度符合要求。按照RT-PCR试剂盒说明书合成cDNA,用RT-PCR方法检测目的基因的mRNA水平,以GAPDH为内参,计算PCR过程各个检测样本的基因相对表达率2-△△CT。引物序列见表1。
表1 RT-PCR各基因引物序列
2.5 Western Blot检测蛋白表达
RIPA提取心肌组织总蛋白,进行蛋白定量并制作5×上样缓冲液;常规制备SDS-PAGE胶,加样进行电泳,结束后电转至PVDF膜,用5%脱脂奶粉封闭液封闭1 h,加入一抗,4 ℃孵育过夜,TBST洗膜后加入二抗(1∶2 000),室温孵育1 h,再次洗膜后使用ECL发光液显影;应用Quantity One 软件以β-actin作为内参,分析蛋白水平。
2.6 统计方法
采用SPSS 17.0软件处理数据,符合正态分布的计量数据采用均数±标准差(x¯±s)表示。方差齐的多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用LSD分析;不符合正态分布或方差不齐时,用非参数检验,两两比较采用Dunnett T3进行分析。以P<0.05表示差异有统计学意义。
3 结果
3.1 心肌形态学观察
透射电镜显示,正常组小鼠心肌细胞结构完好,线粒体结构清晰,内质网清楚完整。模型组小鼠心肌细胞胞浆疏松,内质网及细胞核肿胀,线粒体肿胀、嵴消失。黄芪葛根组相比模型组,内质网与线粒体肿胀不明显。以20周龄为例,结果见图1。
3.2 各组目的基因mRNA表达水平
RT-PCR结果显示,CHOP、PUMA的基因表达,3个周龄段模型组较正常组均明显增加;20周龄黄芪葛根组较模型组有所下降;24、28周龄黄芪葛根组较模型组显著下降(P<0.01),差异有统计学意义,结果见表2。GRP78的基因表达情况,20、24、28周龄模型组较正常组均明显增加,黄芪葛根组较模型组均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),结果见表3。
3.3 各组目的基因蛋白表达水平
GRP78的蛋白表达情况,20、24、28周龄模型组较正常组均明显增加,黄芪葛根组较模型组均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。CHOP、PUMA的蛋白表达,3个周龄段模型组较正常组均明显增加,20周龄黄芪葛根组较模型组有所下降,24、28周龄黄芪葛根组较模型组显著下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果见表4～表5、图2。
图1 20周龄各组小鼠心脏组织的电镜观察 (× 8 000)
表2 各组小鼠CHOP、PUMA mRNA表达情况(x¯±s; n=3)
表3 各组小鼠目的基因GRP78 mRNA表达情况(x¯±s; n=3)
表4 各组小鼠目的基因GRP78 蛋白表达情况(x¯±s; n=3)
表5 各组小鼠目的蛋白表达情况(x¯±s; n=3)
4 讨论
随着现代人生活方式、饮食结构的改变,全球糖尿病的患病人数与日俱增[7],其并发症的患病风险明显增高,糖尿病心肌病已经成为糖尿病患者死亡的主要原因之一[8],因此深入研究DCM的作用机制具有重要的现实意义。
本实验选用KKAy小鼠作为T2DM模型动物。既往研究显示该小鼠经高脂饲料喂养后能稳定保持高血糖状态,且会并发心、肝、脑及肾脏形态和功能的损害[9-12],是研究T2DM病变过程及DCM较好的动物模型。
实验采用的药物为黄芪注射液联合葛根素注射液。研究报道,黄芪在改善血液循环及血液灌注方面作用显著[13],能够扩张血管、抑制血小板聚集、降低血黏度,对糖尿病心肌病的血糖血脂具有明显改善作用。葛根素可对抗肾上腺素的升血糖作用,下调血清晚期糖基化终产物受体过度表达,对抗蛋白糖基化的发展,在糖尿病中降血糖方面效果显著[14]。两者联用可以从不同方面发挥调节DCM血糖血脂的作用。并且从中医角度讲,黄芪利水补气,葛根生津止渴,两者相须为用,功效与DCM气虚血瘀的病机相符。
内质网应激(ERS)介导的细胞凋亡是糖尿病心肌病病变发生发展的重要机制[15],GRP78、CHOP和PUMA是该机制中重要的3个因子。课题组前期实验中发现[16-18],黄芪注射液联合葛根素注射液能降低KKAy小鼠的空腹血糖,改善心肌细胞病理改变,减轻心肌细胞凋亡。本实验在前期工作的基础上,进一步研究两药合用减轻心肌细胞凋亡的具体通路。
实验结果显示,黄芪注射液联合葛根素注射液能明显改善心肌细胞超微结构,降低GRP78基因和蛋白表达,两药联用能够缓解DCM过强的内质网应激。20周龄时黄芪葛根组与模型组相比,CHOP和PUMA基因和蛋白表达有下降趋势,在24、28周龄时黄芪葛根组较模型组下降更明显,说明药物对糖尿病心肌组织的内质网应激相关因子具有较好的抑制作用。
综上所述,黄芪注射液与葛根素注射液联用很有可能是通过抑制糖尿病心肌病ERS、减少心肌细胞的凋亡,起到延缓糖尿病心肌病发展的效果。
参考文献
[1] Goyal BR,Mehta AA.Diabetic cardiomyopathy:pathophysiological mechanisms and cardiac dysfunction[J].Hum Exp Toxicol,2013,32(6):571-590.
[2] 位晨晨,钟明.糖尿病心肌病的发病机制[J].心血管病学进展,2020,41(2):135-139.Wei CC,Zhong M.Pathogenesis of diabetic cardiomyopathy[J].Advances in Cardiovascular Diseases,2020,41(2):135-139.
[3] Frustaci A,Kajstura J,Chimenti C,et al.Myocardial cell death in human diabetes[J].Circulation Research,2000,87(12):1123-1132.
[4] Araki E,Oyadomari S,Mori M.Endoplasmic reticulum stress and diabetes mellitus[J].Internal medicine,2003(42):7-14.
[5] 张淑静,王谦,李姝玉,等.黄芪注射液联合葛根素注射液对2型糖尿病动物KKAy小鼠心脏组织IRE1α和XBP1表达的影响[J].世界中医药,2017,12(12):3050-3054.Zhang SJ,Wang Q,Li SY,et al.Effects of Huangqi injection combined with puerarin injection on KKAy Mice with diabetic cardiomyopathy on endoplasmic reticulum stress[J].World Chinese Medicine,2017,12(12):3050-3054.
[6] 张达,李姝玉,王岩飞,等.黄芪与葛根素联用对KKAy小鼠肾脏内质网应激相关PERK通路的影响[J].中国病理生理杂志,2017,33(1):166-169,173.Zhang D,Li SY,Wang YF,et al.Effects of astragalus injection combined with puerarin injection on process of endoplasmic reticulum stress through PERK pathway in dabe-tic nephropathy mice[J].Chinese Journal of Pathophysiology,2017,33(1):166-169,173.
[7] 中华医学会糖尿病学分会.中国2型糖尿病防治指南(2017年版)[J].中国实用内科杂志,2018,38(4):292-344.Chinese Diabetes Society of Chinese Medical Association.Guidelines for the prevention and control of type 2 diabetes in China (2017 Edition) [J].Chinese Journal of Practical Medicine,2018,38(4):292-344.
[8] Echouffo-Tcheugui JB,Xu H,Devore AD,et al.Temporal trends and factors associated with diabetes mellitus among patients hospitalized with heart failure:Findings from Get With The Guidelines-Heart Failure registry[J].American Heart Journal,2016,182:9-20.
[9] 娄金丽,王谦,郝然,等.KKAy糖尿病鼠心肌损伤及葛根素的干预作用[J].中国病理生理杂志,2009,25(1):59-63.Lou JL,Wang Q,Hao R,et al.Effect of puerarin on myocardial injury in KKAy diabetic mice[J].Chinese Journal of Pathophysiology,2009,25(1):59-63.
[10] 娄金丽,王谦,杨硕,等.糖尿病KKAy小鼠的肝损害[J].细胞与分子免疫学杂志,2008(9):902-903.Lou JL,Wang Q,Yang S,et al.Liver damage in diabetic KKAy mice[J].Chinese Journal of Cellular and Molecular Immunology,2008(9):902-903.
[11] 王谦,娄金丽,柴欣楼,等.自发2型糖尿病模型KKAy小鼠脑微血管病变的研究[J].北京中医药大学学报,2010,33(5):327-329.Wang Q,Lou JL,Chai XL,et al.Pathological changes of cerebral capillary in KKAy mice of spontaneous type 2 diabetic model[J].Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine,2010,33(5):327-329.
[12] 李姝玉,柴欣楼,吴莹,等.黄芪注射液对2型糖尿病动物模型KKAy小鼠肾损伤病理改变的影响[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(18):190-193.Li SY,Chai XL,Wu Y,et al.Effects of astragalus injection on pathological changes of renal damage in type 2 diabetic KKAy mice[J].Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae,2012,18(18):190-193.
[13] 樊克涛,代向东,闫海峰,等.中医药治疗血小板聚集用药规律分析[J].辽宁中医杂志,2017,44(5):1014-1018.Fan KT,Dai XD,Yan HF,et al.Medication rule of TCM treatment of platelet aggregation[J].Liaoning Journal of Traditional Chinese Medicine,2017,44(5):1014-1018.
[14] 刘扬,庞妩燕,苏东月,等.葛根素对实验性2型糖尿病小鼠血糖的影响[J].中国现代药物应用,2011,5(17):52-53.Liu Y,Pang WY,Su DY,et al.The effect of puerarin on blood glucose in experimental type 2 diabetic mice[J].Chinese Journal of Modern Drug Application,2011,5(17):52-53.
[15] Lakshmanan AP,Harima M,Suzuki K,et al.The hyperglycemia stimulated myocardial endoplasmic reticulum (ER) stress contributes to diabetic cardiomyopathy in the transgenic-non-obese type 2 diabetic rats:A differential role of unfolded protein response (UPR) signaling proteins[J].The International Journal of Biochemistry and Cell Biology,2013,45(2):438-447.
[16] 聂彦娜,李姝玉,崔蕾,等.葛根素注射液对高糖诱导的HK-2细胞GRP78 mRNA表达的影响[J].北京中医药大学学报,2014,37(1):39-42.Nie YN,Li SY,Cui L,et al.Influence of puerarin injection on expression of GRP78 mRNA in HK-2 cells induced by high glucose[J].Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine,2014,37(1):39-42.
[17] 张志慧,李姝玉,王岩飞,等.黄芪注射液联合葛根素注射液对糖尿病肾病KKAy小鼠78kD-葡萄糖调节蛋白的影响[J].北京中医药大学学报,2015,38(5):323-326,362.Zhang ZH,Li SY,Wang YF,et al.Effects of astragalus and puerarin injections on the expression of GRP78 in KKAy mice with diabetic nephropathy[J].Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine,2015,38(5):323-326,362.
[18] 李奕萱,王岩飞,李姝玉,等.黄芪注射液与葛根素注射液联用对2型糖尿病小鼠心脏损害的干预作用[J].世界中医药,2018,13(4):940-943.Li YX,Wang YF,Li SY,et al.Effects of astragalus injection conjunction with puerarin injection on cardiac injury in mice with type 2 diabetes mellitus[J].World Chinese Medicine,2018,13(4):940-943.
