摘 要：
目的 探讨健脾清化舒络中药对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠Sonic Hedgehog信号通路的影响。方法 雄性Wistar大鼠59只,随机分为空白对照组16只、造模组43只,采用复合造模法进行病证结合CAG模型构建,期间随机抽取造模组大鼠3只验证CAG造模是否成功。造模成功后,予健脾清化舒络中药(复方胃炎合剂)进行相关干预。具体干预方案为:将空白对照组随机分为空白组、健脾清化舒络中药高剂量[61.04 g/(kg·d)]空白组,造模组随机分为CAG模型组、维酶素[0.2 g/(kg·d)]组和健脾清化舒络中药低、中、高剂量[15.26、30.52、61.04 g/(kg·d)]组,每组8只,给予相应药物连续干预4周。检测大鼠胃组织Shh、Ptch1、Smo、Gli1、Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达水平及血清中白细胞介素-1β(IL-1β)、胃泌素(GAS)含量。结果 与空白组比较,模型组大鼠Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达及血清GAS水平降低,Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达及血清IL-1β水平上升,差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01)。与CAG模型组比较,健脾清化舒络中药低、中、高剂量组胃黏膜病变显著改善,Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达上调,Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达下调,血清IL-1β水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05、P<0.01),健脾清化舒络中药中、高剂量组血清GAS水平上升(P<0.05)。结论 健脾清化舒络中药可有效改善CAG大鼠胃黏膜组织病理改变,其机制可能与调控血清IL-1β、GAS含量,重新激活下游Sonic Hedgehog信号通路的表达有关。
关键词：
慢性萎缩性胃炎 健脾清化舒络中药 Sonic Hedgehog信号通路 大鼠
Effect of spleen-fortifying,fire-clearing and collateral-unblocking medicinals on Sonic Hedgehog signaling pathway in rats with chronic atrophic gastritis
Li Sihan Lin Xiuming Tian Lin Li Mingzhu Huang Minghan
School of Basic Medical Sciences,Guangzhou University of Chinese Medicine; The Second People's Hospital of Funjian Province Affiliated to Fujian University of Traditional Chinese Medicine;
Abstract：
Objective To explore the effect of spleen-fortifying, fire-clearing and collateral-unblocking(SFC) medicinals on Sonic Hedgehog signal pathway in rats with chronic atrophic gastritis(CAG). Methods 59 male wistar rats were randomly divided into the control group(n = 16) and model group(n = 43). The CAG model was established by comprehensive modeling method. After that, 3 rats in the model group were randomly selected for gastric pathological examination. After the model was successfully established, the compound gastritis mixture(under the guidance of the SFC method) was given as a representative drug for relevant intervention. Specifically, the control group was randomly divided into blank group, blank + high dose SFC group, while the model group was randomly divided into CAG group, Vitacoenzyme group, low dose, medium dose and high dose SFC groups(n=8). The corresponding drugs were given continuously for 4 weeks. At last, the protein expression levels of Shh, Ptch1, Smo, Gli1, Gli2, Gli3 and Sufu in gastric tissue and the concentration of IL-1 β and GAS in serum were measured. Results In the model group, the expression of Shh, Ptch1, Smo, Gli1 protein and the level of serum GAS decreased, while the expression of Gli2, Gli3, Sufu protein and the level of serum IL-1β increased(P<0.05, P<0.01). Compared with the CAG group, the pathological changes of gastric mucosa in the low, middle and high dose SFC groups were significantly improved, the expression of Shh, Ptch1, Smo and Gli1 protein increased, and the expression of Gli2, Gli3, Sufu protein and the level of serum IL-1β decreased(P<0.05, P<0.01). The level of serum GAS in middle and high dose SFC groups increased significantly(P<0.05). Conclusion SFC method could possibly improve the pathological changes of CAG in rats, and its mechanism may be related to improving the contents of serum IL-1β and GAS and reactivating the expression of Sonic Hedgehog signal pathway.
Keyword：
chronic atrophic gastritis; spleen-fortifying,fire-clearing and collateral-unblocking(SFC) medicinals; Sonic Hedgehog signal pathway; rats;
慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,CAG)是消化系统常见的胃黏膜慢性病变,主要组织病理学改变包括胃黏膜萎缩、肠化、上皮内瘤变,具有病程长、易复发、难治愈的特点[1]。人群胃镜检出率为7.5%～13.8%,发病率与年龄增长呈正相关[1-3]。在胃组织中,Sonic Hedgehog(Shh)信号通路的异常表达可通过调节细胞类型特异性基因的表达来影响细胞增殖、迁移和分化[4],与CAG胃黏膜病变的进展及胃癌的发生关系密切[5-7]。福建中医药大学附属第二人民医院脾胃病科是国家中医药管理局慢性胃炎诊疗协作组副组长单位,我们在总结国医大师杨春波教授“胃炎1号”[8]“胃炎合剂”[9]疗效基础上,结合中医证素调查创制健脾清化舒络中药——复方胃炎合剂(compound gastritis mixture,CGM),临床治疗CAG疗效肯定[10]。本研究通过建立病证结合CAG大鼠模型,从Sonic Hedgehog信号通路进一步明确复方胃炎合剂阻断或逆转CAG进展的分子机制,以期为复方胃炎合剂临床推广提供依据。
1 材料
1.1 动物
SPF级Wistar雄性大鼠59只,体质量为(110±10)g,购于上海莱斯克实验动物有限公司,动物许可证编号:[SCXK(沪)2017-0005],饲养于福建中医药大学SPF级动物实验中心,分笼饲养, 环境温度(23±2) ℃,空气湿度55%±5%。
1.2 伦理审查
本研究经福建中医药大学附属第二人民医院动物实验伦理委员会审核通过,设计方案符合安全性和公平性原则,实验动物符合国家对医学实验动物的有关要求,审核批号: FJPSPH-IAEC2018001。
1.3 药物
健脾清化舒络中药由福建中医药大学附属第二人民医院药剂室负责制备。药物组成:炙黄芪150 g,党参100 g,炒白术100 g,茯苓150 g,枳壳60 g,白芍100 g,法半夏100 g,砂仁45 g,佩兰100 g, 黄连30 g,陈皮60 g,地龙150 g,莪术60 g,甘草30 g。 煎液时加8倍量水浸泡0.5 h后煎煮3次,第1次1.5 h,第2次1 h,第3次0.5 h,合并煎液,滤过。滤液在60～70 ℃减压浓缩至500 mL,药液浓度为含生药2.47 g/mL,灭菌分装,4 ℃冰箱存用。盐酸雷尼替丁胶囊,0.15 g/片,赛诺菲(杭州)制药有限公司生产,国药准字H33021741。维酶素片,0.2 g/片,北海阳光药业有限公司生产,国药准字H45021183。
1.4 试剂与仪器
1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍,百灵威科技有限公司,货号:OR301388。Sonic Hedgehog兔抗多克隆抗体,ProteinTech,货号:20697-1-AP;Ptch1兔抗多克隆抗体,Sigma,货号:AV44249;Smo鼠抗单克隆抗体,ProteinTech,货号:66851-1-Ig;Gli1鼠抗单克隆抗体,ProteinTech,货号:66905-1-Ig;Gli2兔抗多克隆抗体,ProteinTech,货号:18989-1-AP;Gli3兔抗多克隆抗体,ProteinTech,货号:19949-1-AP;Sufu兔抗多克隆抗体,ProteinTech,货号:26759-1-AP。β-actin鼠抗单克隆抗体,Immunoway,货号:YM3029;山羊抗兔IgG,康为世纪,货号:CW0103S;山羊抗小鼠IgG,Solarbio,货号:SE131。白细胞介素-1β(IL-1β) ELISA试剂盒,ProteinTech,货号:KE20005 ;胃泌素(GAS) ELISA试剂盒,江苏酶免实业有限公司,货号:MM-21284R。
低温冷冻离心机,Eppendrof,型号:5424R;电动组织匀浆器,天根生化,型号:OSE-Y30/Y40;酶标仪,Bio Tek,型号:SN257300;电泳仪,Bio-Rad,1645070;凝胶成像系统,上海天能科技有限公司,型号:Tanon 1600。
2 方法
2.1 分组与模型构建
空白对照组16只,SPF级动物标准饮食喂养。造模组43只,正常饲养,造模方法参照文献[11-12]并加以改进。以120 mg/L 1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍溶液自由饮用,每日予雷尼替丁0.03 g/kg灌胃,每周45%乙醇空腹灌胃2次,每次2 mL,同时给予饥饱失常喂养法(每周禁食1次,24 h/次),连续造模24周。经上述造模干预,造模组大鼠逐渐出现被毛蓬乱、松散,毛色枯黄无光泽,眯眼少神,活动迟钝,喜拱背、扎堆,食欲食量下降。24周末,随机处死3只造模组大鼠,取胃行病理检查,判断CAG模型造模成功与否。
CAG造模成功后,模型组大鼠以单日禁食自由饮水、双日予足量高脂高糖饮食,即20%蜂蜜水自由饮用,隔日上午灌服油脂10 g/kg,下午灌服56度白酒10 mL/kg;14 d后放入人工气候箱中,温度(32±2) ℃,相对湿度95%,共计5 d。经上述造模干预,造模组大鼠逐渐出现小便量多色黄,大便溏或黏稠发暗、馊臭明显,造成脾虚痰湿热瘀证CAG大鼠模型。
模型成功构建后,采用随机数字法将造模大鼠分为模型组、维酶素组和健脾清化舒络中药低、中、高剂量组,每组8只;将空白对照组分为空白组、健脾清化舒络中药高剂量空白组,每组8只。
2.2 药物干预
各组给予相应药液,依据临床应用等效剂量换算,健脾清化舒络中药低、中、高剂量分别为15.26、30.52、61.04 g/(kg·d),维酶素给药剂量为0.2 g/(kg·d),根据大鼠体重将药液用生理盐水稀释灌胃,每次5 mL/只。空白组及模型组每次给予5 mL/只生理盐水灌胃。药物干预周期共30 d 。
2.3 标本制备与采集
相应药物干预结束后,大鼠予禁食12 h,随后将大鼠放入大小适中透明玻璃罩中,再将浸有乙醚的棉球投入玻璃罩内,观察大鼠的呼吸节律和运动情况。待麻醉成功后,沿大鼠腹部正中线剖开腹腔,用一次性真空采血管收集腹主动脉血5 mL,所取全血室温凝固2 h,3 000 r/min 有效离心半径15 cm离心15 min,分离血清,分装后-80 ℃冻存备用。随即分离胃,沿胃大弯剖开,生理盐水冲洗,取幽门、前胃与腺胃交界线连线的2/5部分,放入冻存管中,置于液氮中速冻,随后置于-80 ℃冻存备用;胃窦部装入盛有10%福尔马林液的试管中固定。
2.4 行为学观察
观察大鼠的精神状态、毛发、体重、活动度、食欲、二便等。
2.5 HE染色评价病理组织学改变
取胃组织连续切片5张,HE染色,光学显微镜下观察了解胃黏膜变化情况,观察各组给药前后胃黏膜的病理组织学改变。
2.6 胃组织相关蛋白表达
胃组织用预冷RIPA裂解液提取蛋白,BCA法测定蛋白浓度,SDS-PAGE电泳分离蛋白,转移蛋白质于PVDF膜,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,一抗4 ℃孵育12 h,二抗室温孵育2 h,ECL检测目的蛋白条带。灰度值用Image J软件分析,蛋白的相对含量以目的蛋白与β-actin的条带灰度比值表示。
2.7 ELISA检测
将冻存于-80 ℃的大鼠血清取出,室温解冻,检测各组大鼠血清中IL-1β、GAS含量。操作步骤严格依据ELISA试剂盒说明书进行。
2.8 统计方法
所有数据输入SPSS 20.0统计软件进行处理,符合正态分布或近似符合正态分布的计量资料以均值±标准差(x¯±s)表示。方差齐的多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),组间两两比较采用LSD检验。P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 一般行为学表现
经过复合造模后,造模组大鼠与空白对照组大鼠比较,出现倦怠懒动,反应较迟钝,被毛松散,毛色枯黄,缺乏光泽,喜拱背、扎堆蜷卧,皮肤疏松,食量减少,小便量多色黄,大便黏腻臭秽,唇周色暗,各种症状符合中医脾虚痰湿热瘀证的临床证候。经健脾清化舒络中药治疗后,各组大鼠的上述症状均得到一定缓解,其中以中药中、高剂量组改善最为明显。
3.2 病理学评价
各组大鼠胃组织病理结果见图1。空白组和健脾清化舒络高剂量空白组大鼠胃黏膜细胞和腺体排列整齐、结构完整,形状和大小基本一致,无炎性细胞浸润,黏膜下层和肌层连续,为胃组织正常病理学表现。模型组大鼠胃黏膜层变薄和腺细胞减少,细胞核形状、大小不一,腺管不完整,可见明显的淋巴细胞、浆细胞浸润,伴有肠上皮化生和上皮内瘤变。镜下观察结果说明大鼠CAG模型构建成功。维酶素组和健脾清化舒络中药低、中、高剂量组大鼠胃黏膜厚度均有较模型组明显增加。其中维酶素组和健脾清化舒络中药低剂量组大鼠可见黏膜下层和基层增厚,纤维组织增生,细胞排列仍不甚规则,细胞核形状、大小较模型组均一。健脾清化舒络中、高剂量组大鼠胃黏膜细胞排列较为整齐,细胞核形状、大小较为均匀,腺管结构相对完整,未见明显炎性细胞浸润。
3.3 胃组织Shh、Ptch1、Smo蛋白表达比较
与空白组比较,模型组大鼠Shh、Ptch1、Smo蛋白表达量显著降低(P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠Shh、Ptch1、Smo蛋白表达量均显著升高(P<0.05、P<0.01),其中以健脾清化舒络中药中、高剂量组疗效差异最显著(P<0.01)。结果见表1。各组大鼠胃组织Shh、Ptch1、Smo蛋白表达电泳图见图2。
3.4 胃组织Gli1、Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达比较
与空白组比较,模型组大鼠Gli1蛋白表达量显著降低(P<0.01),Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达量显著升高(P<0.01);与模型组比较,各治疗组大鼠Gli1蛋白表达量显著升高(P<0.01),Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达量显著降低(P<0.01)。结果见表2。各组大鼠胃组织Gli1、Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达电泳图见图3。
表1 各组大鼠胃组织Shh、Ptch1、Smo蛋白表达(x¯±s; n=8)
表2 各组大鼠胃组织Gli1、Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达(x¯±s; n=8)
3.5 各组大鼠血清 IL-1β及GAS水平的比较
与空白组比较,模型组大鼠IL-1β显著升高(P<0.01), GAS显著降低(P<0.01);与模型组比较,各治疗组IL-1β显著降低(P<0.05,P<0.01),各治疗组GAS均有所上升,其中健脾清化舒络中药中、高剂量组 GAS显著升高(P<0.05)。结果见表 3。
4 讨论
作为胃癌的重要癌前疾病,及时阻断或逆转CAG的病情进展,对于胃癌的防治有重要意义。在前期研究中,我们结合福建地域特点,认为CAG证候多以脾胃气虚为本,痰、湿、热、瘀为标,其病机为脾胃气虚,脾胃运化功能失健,饮食水谷停聚,聚湿成痰,蕴久化热,损伤胃络,久踞则胃络瘀滞,痰、湿、热、瘀交阻,致胃黏膜腺体萎缩、肠上皮化生或上皮内瘤变。[13-14]根据该病机,制定本病的主要治法为健脾清化舒络法。课题组在该法指导下和对“胃炎1号”“胃炎合剂”疗效总结基础上,结合证素调查结果创制“复方胃炎合剂”。方中以四君子汤(党参、炒白术、茯苓、甘草)及炙黄芪健运脾胃、补益中气,配法半夏、陈皮理气化痰,佩兰、砂仁芳香化湿,黄连清热化痰,枳壳、地龙、莪术理气祛瘀、通络止痛,加白芍与甘草相配缓急止痛。诸药合用,标本兼治,寒温平调,共奏健脾清化、祛痰理气、散瘀舒络之功,以达阻断、逆转CAG病理改变之效。
图2 各组大鼠胃组织Shh、Ptch1、Smo蛋白表达电泳图
图3 各组大鼠胃组织Gli1、Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达电泳图
表3 各组大鼠血清IL-1β、 GAS水平的比较(x¯±s; n=8)
有研究表明[15-16],Shh信号通路表达异常与胃黏膜萎缩、肠化、上皮内瘤变及胃癌的发生有着密切的联系。Nusslein-Volhard和Wieschaus利用果蝇的突变筛选,首先发现了Hedgehog (Hh)基因[17],随后鉴定了从果蝇到哺乳动物都非常保守的3个同源物,分别为Sonic Hedgehog (Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)和Desert Hedgehog (Dhh)。Shh信号通路内部具有反馈调节机制,通常情况下,Smo 是正向激活转录因子,但Ptch1受体能抑制 Smo蛋白活性,从而抑制下游通路的激活,实现通路内部的自我调节[18-19]。Hh通路的转录因子是 Gli 蛋白家族,包括Gli1、Gli2、Gli3亚型。Sufu是Hh途径的重要负调控因子,响应Smo调节而触发的磷酸化决定了初级纤毛内Shh通路成分的定位,并参与Smo-Sufu-Gli轴的调控[20]。在哺乳动物体内,Shh是Hh的3个同源物中分布最广,通路机制研究也是最为深入的一个信号分子[21-23]。在胃组织中,胃上皮产生的Shh在胞浆内经过一系列反应后形成具有信号转导功能的成熟肽,以旁分泌的形式分泌出细胞外,并作为Shh信号通路的配体靶向作用于间质细胞,与Ptch1的12次跨膜受体结合[24],从而解除Ptch1对G蛋白偶联受体Smo的抑制作用[25]。活跃的Smo通过微管运输将Shh信号向细胞内传递,导致Sufu-Gli在细胞纤毛上募集,随后复合物迅速解离[26],激活Gli蛋白家族形成转录激活子,Gli1、Gli2、Gli3蛋白由细胞浆转位至细胞核,与DNA共有位点(5'-GACCACCCA-3')结合促进靶基因表达[27]。实际上,当Shh不存在时,受体Ptch1抑制Smo的功能,转录因子Gli2和Gli3经蛋白酶解加工,生成缺少转录激活域的转录因子抑制形式,入核后抑制Shh靶基因的表达;当Shh存在时,Shh与Ptch1结合后,Smo的抑制作用被解除,Sufu-Gli解离,Gli2和Gli3 蛋白酶解加工步骤被阻断,形成转录激活子,入核促进靶基因表达。其中,Gli1不受蛋白酶加工处理,是Shh通路中主要转录激活子。
在既往的研究中,关于CAG与脾虚及痰、湿、热、瘀证关系的临床总结和实验研究均已较为深入[28-30],也已明确Shh信号通路调控异常是CAG向胃癌转化的重要机制之一[31]。而涉及“证”与Shh信号通路的研究和论述却相对较少,研究多关注Shh信号通路与脾虚、痰、瘀间的关系[32-34]。湿、热作为CAG发生炎-癌转化的重要因素,可增加肿瘤易感性、侵袭性和转移性,与Shh信号通路的研究尚需进一步完善。而对于CAG脾虚痰湿热瘀证与Shh信号研究尚欠缺、应用健脾清化舒络法治疗CAG的具体机制亦待进一步阐明,本文可填补此部分空白。
在本研究中,通过胃病理结果,可以证实该病证结合复合造模法,能较好构建大鼠CAG模型,并体现脾虚痰湿热瘀证的证候表现。CAG模型组大鼠采用维酶素和健脾清化舒络中药各剂量治疗后,大鼠的胃黏膜病理均在一定程度上获得改善,其中健脾清化舒络中药中、高剂量组疗效显著,与前期临床研究相符,表明该方治疗CAG疗效肯定。在对Shh信号通路的研究中发现,CAG模型组大鼠Shh、Ptch1、Smo、Gli1蛋白表达较空白组出现下调,同时Gli2、Gli3、Sufu蛋白表达较空白组出现相应上调,与既往的研究一致[35]。因此我们认为,当胃黏膜处于萎缩状态时,Shh信号通路处于抑制状态,采用健脾清化舒络为治法,经过健脾清化舒络中药治疗后,Shh信号通路可被重新激活,这可能是健脾清化舒络中药治疗CAG的分子基础。
另有研究提示,胃黏膜在低酸条件可以阻止Shh加工[36]。而IL-1β是胃酸分泌的有效抑制剂[37-38],能通过阻断细胞内钙离子分布和钙依赖性蛋白激酶C增加来抑制胃酸分泌[39-40]。GAS也可通过钙依赖性机制促进胃酸生成[41],并能够促进胃窦、胃体收缩、增加胃肠道的运动,是调节胃肠道运动的兴奋性胃肠肽[42]。有研究表明,GAS缺乏的小鼠Shh蛋白表达显著降低,而再输注GAS可改善Shh蛋白表达[36]。因此,在上述研究的基础上,我们采用ELISA法检测血清中IL-1β及GAS水平,发现CAG模型组中大鼠血清IL-1β上调,而GAS下调。故我们推测,Shh信号通路的抑制,可能是因为大鼠体内IL-1β及GAS水平的改变导致胃黏膜处于低酸环境,阻止了Shh的有效表达,进一步引起其下游信号通路分子表达的改变。GAS的下调导致胃肠道兴奋性降低,加之胃中低酸的环境进一步导致脾虚、运化失常,引起水谷积聚中焦,痰湿热内生,阻滞胃络,腺体萎缩,痰湿热瘀内阻导致以自分泌和旁分泌为主的Shh在CAG大鼠中的生成和分泌显著减少。经过药物干预后,各治疗组大鼠IL-1β及GAS水平均趋于好转。因此我们认为,健脾清化舒络中药可能通过抑制IL-1β和上调GAS,从而进一步激活下游Shh信号通路的表达。但中药复方多具有多靶点的治疗作用,因此,不排除健脾清化舒络中药在下调IL-1β和上调GAS时,存在同时激活Shh信号通路Shh配体的可能,具体是否存在此种交互作用机制,有待今后进一步研究阐明。
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