摘 要：通过对不同霉变程度的黄精进行气味指纹分析，探究黄精霉变过程中的气味变化规律与其霉变程度的关系，根据电子鼻的响应强度建立判别黄精是否霉变的快速判别模型。运用α-FOX3000电子鼻对不同霉变程度的黄精进行气味指纹分析，利用雷达图解析电子鼻挥发性化合物的主要贡献成分，通过偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）、最邻近分类法（KNN）、序列最小最优化算法（SMO）、随机森林（Random Forest）、朴素贝叶斯（Naive Bayes）对特征数据进行处理和分析。根据电子鼻的雷达图可以得出，随着黄精样品的霉变程度不断加深，传感器T70/2、T30/1、P10/2的响应值一直在增强，说明霉变后的黄精产生了烷烃类和芳香族类化合物；根据PLS-DA分析，3类黄精样品可以很好地被区分，对传感器进行变量重要性分析，筛选出对分类贡献较大的传感器有5根：T70/2、T30/1、PA/2、P10/1、P40/1；在KNN、SMO、Random Forest、Native Bayes 4个分类模型中，4个模型的分类准确率均达到90%以上，其中KNN为最佳分类模型，准确率为97.2%。霉变前后的黄精具有明显气味变化，产生了不同的挥发性有机物，这种差异可以被电子鼻识别，并建立了快速判别模型，为后续黄精霉变过程中挥发性物质种类和含量的研究提供方法参考。
关键词:黃精; 变子鼻;气味;快速判别模型;气味指纹图谱;
Establishment of a fast discriminant model with electronic nose for Polygonati Rhizoma
mildew based on odor variation
YU Shu-lin GONG Jin-ting LILi GUAN Jia-li ZHAI En-ai OUYANG Shao-qin ZOU Hui-
qin YAN Yong-hong
School of Chinese Materia Medica, Beijing University of Chinese Medicine Beiing Institute of
Traditional Chinese Medicine
Abstract：The odor fingerprint of Pollygonati Rhizoma samples with different mildewing degrees was analyzed and the relationship between the odor variation and the mildewing degree was explored. A fast discriminant model was established according to the response intensity of electronic nose. The α-FOX3000 electronic nose was applied to analyze the odor fingerprint of Pollygonati Rhizoma samples with different mildewing degrees and the radar map was used to analyze the main contributors among the volatile organic compounds. The feature data were processed and analyzed by partial least squares discriminant analysis (PLS-DA), K-Nearest neighbor (KNN), Sequential Minimal Optimization (SMO), Random Forest (RF) and Naive Bayes (NB), respectively. According to the radar map of the electronic nose, the response values of three sensors, namely T70/2, T30/1, and P10/2, increased with the mildewing, indicating that the Pollygonati Rhizoma produced alkanes and aromatic compounds after the mildewing. According to PLS-DA model, Pollygonati Rhizoma samples of three mildewing degrees could be well distinguished in three areas. Afterwards, the variable importance analysis of the sensors was carried out and then five sensors that contributed a lot to the classification were screened out: T70/2, T30/1, PA/2, P10/1 and P40/1. The classification accuracy of all the four models (KNN, SMO, RF, and NB) was above 90%, and KNN was most accurate (accuracy: 97.2%). Different volatile organic compounds were produced after the mildewing of Pollygonati Rhizoma, and they could be detected by electronic nose, which laid a foundation for the establishment of a rapid discrimination model for mildewed Pollygonati Rhizoma. This paper shed lights on further research on change pattern and quick detection of volatile organic compounds in moldy Chinese herbal medicines.
Keyword：Pollygonati Rhizoma; mildew; electronic nose; odor; fast discriminant model; odor fingerprint;
黄精以“女萎”之名始载于《神农本草经》，《名医别录》中将“黄精”用作于正名，均为上品[1]。黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianum Coll. et Hemsl.、黄精P. sibiricum Red. 或多花黄精P. cyrtonema Hua的干燥根茎，味甘、性平，归脾、肺、肾经，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾的功效[2]。黄精作为药食同源的传统中药历史悠久，于2002年被国家健康委员会列入《既是药品又是药品的物品名单》后，被一直沿用至今[3]。黄精作为中药具有多方面药理活性，包括抗衰老[4]、抗肿瘤[5]、抗抑郁[6]、抗疲劳[7]、抗骨质疏松[8]等，作为食品原材料也被广泛应用于饮料、蜜饯、保健品等行业[9]。正因其独特的药用和食用价值，黄精饮片的年销量逐年攀增[10]。然而，遇到储藏条件不佳或运输条件不当时，黄精容易发生霉变、虫蛀等变质现象。有研究表明[11]，黄精及其炮制品霉变后黄精多糖的含量会明显下降，且炮制后多糖含量增加的黄精更易发生霉变现象。而黄精多糖作为黄精的主要活性成分，当黄精霉变导致其含量降低后势必会影响黄精的药效，有甚者产生真菌毒素，危害生命健康与公共安全。因此，针对黄精霉变早期建立一种快速、准确的鉴别方法，是一个亟待解决的问题，这也是保证药材质量，保障人类生命安全的重要问题。
目前针对中药霉变的检测主要依靠人工感官分析法和理化检测法。人工感官分析法依赖检测人员对中药的色泽、气味、形状、质地等进行判定，这种判定方法检测范围小，效率低，经验依赖性强[12]；理化检测方法主要包括化学仪器分析法、免疫学方法等，这些方法虽然检测精度高，但操作复杂，检测时间较长，成本高，需要对样品进行预处理[13]。因此，亟需建立一种快速、准确、无损的中药霉变检测方法。
电子鼻由采样系统，传感器阵列单元，数据采集和处理系统组成，可用于检测不同挥发性化合物并提供所分析化合物的气味指纹图谱（smellprint）。电子鼻作为一种基于挥发性化合物变化的气味检测技术，具有快速、无损、灵敏等优点，已经被广泛用于食品检测、医疗疾病诊断、环境监测、中药鉴定、农作物霉变监测等领域[14,15,16,17,18]。电子鼻的成功应用也伴随着电子鼻数据处理方法的不断发展，数据处理的方法的从最基本的主成分分析法、线性判别分析法[19]发展到了与深度学习模型[20]（CNN、LSTM）相结合。选择合适的判别模型不仅能缩短电子鼻数据处理的时间，而且能提高模型的分类正确率。田慧玄[21]等人利用电子鼻与HS-GC-MS技术结合主成分分析法成功判别出不同霉变程度的肉豆蔻；宁景苑[22]等人探索出一种基于多传感器融合感知的白芨霉变快速检测系统，建立了一种适用于快速检测白芨霉变的非线性信号分析模型。
基于以上分析，针对黄精霉变的现象发生，本文采用电子鼻结合多种数据处理方法，尝试建立能快速判别不同霉变程度黄精的检测分类模型，以期为实现黄精霉变在线监控的预警系统提供技术参考。
1.材料
1.1 黄精样品
黄精样品于2019年7月采摘于辽宁省瓦房店市，经北京中医药大学中药鉴定系闫永红教授进行鉴定为百合科植物黄精P. sibiricum的干燥根茎，2019年7月—2021年7月储存于北京市中医药研究所，2021年8月至今储存于北京中医药大学（良乡校区）中药学院实验室。
1.2 仪器与设备
α-FOX3000电子鼻（法国Alpha M.O.S公司）；BS-124S电子分析天平（德国赛多利斯科学仪器北京有限公司）；FW-135中草药万能粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。
2. 方法与结果
2.1 样品制备
采用显微镜直接观察法对黄精样品的表面/断面进行微性状观察，根据霉菌的覆盖面积对24批黄精样品进行不同霉变程度的划分。自然留样黄精样品共6批分为：生黄精未霉变样品3批；生黄精自然霉变样品为2019年7月—2021年7月在干燥储存过程中发生霉变的3批样品，打粉，过65目筛。同时为了获得不同霉变程度的黄精样品，采取人工模拟培养方式，加速黄精霉变，缩短培养周期。分别将生黄精、制黄精粉末各3批置于恒温恒湿生化培养箱（温度30 ℃，湿度90%）内培养8 d，获得黄精霉变实验样品12批；未霉变的生黄精粉末3批，未霉变的制黄精粉末3批。综上，本次实验样品共24批，见图1、2和表1。
表1 黄精实验样品制备
2.2 电子鼻系统
采用α-FOX3000电子鼻检测系统。该设备主要由自动顶空进样仪HS100和主机两大部分组成，主机安装有12根金属氧化物传感器，传感器的编号、型号及检测范围见表2。每根传感器因其对特定气体种类的不同传感能力而呈现出不同的响应，12根传感器构成传感器阵列，对黄精样品顶空气体中的成分进行综合性检测，形成黄精样品的气味指纹图谱信息，从而实现对不同霉变程度黄精样品的分类检测。
表2 α-FOX3000电子鼻的12根传感器信息
2.3 黄精气味指纹分析方法的建立
影响电子鼻信号响应强度的因素主要有样品量、样品粒径、孵化温度、孵化时间、进体积、样品震荡速度、数据采集时间、采集延迟时间等，不同的电子鼻参数会对电子鼻的信号产生不同程度的影响。因此需要寻找最优的电子鼻参数，得到电子鼻信号的最佳响应值。
2.3.1 电子鼻参数优化
为了获得最佳的电子鼻信号响应强度，保证黄精样品气味指纹分析方法的可靠性、稳定性和可重复性，本实验通过单因素实验考察了对电子鼻信号响应强度影响较大的因素，并根据分析结果对电子鼻参数进行优化。预实验考察了孵化温度（35、40、45、50、55 ℃ 5个水平）、孵化时间（300、400、500、600 s 4个水平），基于相对标准偏差（RSD）分析得出本实验最适孵化温度为50 ℃，最适孵化时间为500 s，其他分析参数见表3。以此为电子鼻检测条件，精密称取黄精样品粉末0.3 g，装入10 mL顶空进样瓶，每组设6次重复。
表3 电子鼻最优参数设置 导出到EXCEL
Table 3 Optimal parameters of electronic nose
2.3.2 黄精样品电子鼻数据分析
传感器最大响应值是区分气体种类最常用的也是最重要的特征之一[23]。为了综合分析不同霉变程度黄精的组间差异性，采用偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）对电子鼻数据的最大值进行分析，建立有监督模式的PLS-DA模型，同时对传感器进行变量重要性投影分析，进行传感器的初步筛选。然后用KNN、SMO、Random Forest、Naive Bayes四种分类模型对不同霉变程度的黄精样品进行精确的分类识别，通过模型的参数优化和模型的指标评价找到判别不同霉变程度黄精的最佳模型。
2.3.3 模型评价
对数据集采用十折交差验证法和外部测试集法两种方法进行分类测试。采用查准率（Precision, P）、平均绝对误差（mean absolute error, MAE）、均方根误差（root mean squared error, RMSE）、ROC Area 4个指标对分类模型进行评价。查准率是指真正正确的个数占整个结果的比例，用来衡量分类器的正确率；平均绝对误差和均方根误差用来衡量分类器预测值和实际效果的差异，数值越小，分类器越好；ROC Area是在0到1范围内的数，ROC Area的值越接近1，说明模型的分类效果越好。
2.3.4 数据处理
本实验采用的数据处理软件包括MetaboAnalyst 5.0（MetaboAnalyst）、 Weka 3.8.5（http://www.cs.waikato.ac.nz/ml/weka/），绘图工具为Excel（Microsoft Office 2021学生版）。
3 结果
3.1 基于电子鼻信号黄精样品的气味指纹信息
每根传感器对不同霉变程度的黄精样品产生不同的响应强度，见图3。6根传感器LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCTl、LY2/gCT几乎没有响应值，且随着黄精霉变程度的加深，6根传感器的响应值并无明显变化，这说明黄精霉变过程中很少产生氨气、硫化氢、有机胺类等挥发性化合物，与相关研究结果相符[24,25]。对于黄精样品的气味指纹信息产生主要贡献的是6根传感器PA/2、P10/1、P10/2、P40/1、T30/1、T70/2。随着黄精霉变程度的加深，传感器T70/2、T30/1、P10/2、PA/2的响应值不断增强，说明霉变后的黄精主要产生了烷烃类和芳香族类挥发性化合物，与已有的相关研究结果一致[26]。
3.2 基于电子鼻信号黄精样品的PLS-DA分析
对不同霉变程度的黄精样品电子鼻所测得数据进行PLS-DA分类分析，分析结果见图4。PC1的贡献率为94.8%，PC2的贡献率为4.2%，综合贡献率为98.6%。黄精和轻微霉变黄精、霉变黄精三者之间的差异主要表现在PC1上。黄精和轻微霉变黄精的差异主要表现在PC2上；黄精和霉变黄精以及轻微霉变黄精和霉变黄精之间的差异主要表现在PC1上。在轻微霉变黄精区域和霉变黄精区域各分别出现一个检测样本交叉，这可能是由于在人为划定霉变程度时出现霉变程度的判断边界模糊。根据图4可以看出，黄精样品和轻微霉变黄精样品区域存在重叠，这说明PLS-DA模型并不能完全将3类不同霉变程度的黄精样品区分开，需要运用模式判别分类模型进行准确分类。
对PLS-DA模型进行变量重要性投影分析，变量重要性投影值（VIP）可以量化每个变量对分类的贡献。当VIP＞1，可以将对应的变量定义为判别模型的关键变量[27]。VIP＞1的传感器有五根，分别为T70/2、T30/1、PA/2、P10/1、P40/1，说明这5根传感器可以看作影响不同霉变程度黄精样品分类差异较大的传感器，这与3.1项中的分析基本一致，可以为后续霉变黄精传感器优化的研究提供方法参考，见图5。
3.3 基于电子鼻信号的模式判别分类模型建立
模式判别分类模型的选择并不是查准率越高越好，需要综合各指标的评价选择最适的分类模型完成对目标样本的分类，才能达到最佳的分类效果。在十折交叉验证法和外部测试集2种的方法下，4种分类模型的查准率均超过了0.900，均具有很高的正确率。KNN模型和SMO的模型的查准率都超过0.950，对目标的分类具有更高的正确率，尤其是SMO模型在外部测试集的方法下查准率和Roc Area在4个模型中表现最好。但是SMO模型的MAE和RMSE的值为0.231 5、0.288 7和0.227 4、0.281 5，均比其他分类模型高出很多，这说明SMO模型并不是最佳分类模型；而KNN模型的MAE和RMSE值在4个模型中最低，分别为 0.028 2、0.135 0和0.042 9、0.174 1，见表4。综合考虑各指标，选择在十折交叉验证法下的KNN模型作为判别不同霉变程度黄精样品的最佳分类模型。
4 讨论
近年来，随着中药在国际市场上持续升温，在保证中药药效的基础上，中药安全性相关研究已经成为公众持续关注的焦点。影响中药安全性的因素多种多样，其中霉变尤其是霉变后的中药产生真菌毒素是主要因素之一。由于中药的霉变主要是由于中药材从种植、采收、加工、运输、储藏到市场流通等过程均易沾染真菌，进而发生霉变，而真菌在自然生长的过程中自身的代谢活动会产生挥发性有机物气体[28]，这也是电子鼻能作为中药霉变检测技术的原因之一。因此针对中药霉变的问题，电子鼻作为当下快速且准确的检测技术已经在谷物霉变和中药霉变方面展示出巨大的潜力。在中药霉变方面，电子鼻作为一种模仿人类嗅觉工作原理的现代人类智能仿生技术，不仅具有传统性状鉴别的经验转化为客观化数据的特点，还具有检测速度快、响应迅速，能有效避免由人为因素产生的误差等特点[29]。
本研究采用电子鼻检测不同霉变程度的黄精样品，传感器最大响应值的雷达图可以很好的反映出对于黄精电子鼻信号的产生主要贡献的挥发性成分主要是烃类、芳香族类化合物、有机胺类、醇类等化合物；对于不同霉变程度的黄精，传感器T70/2、T30/1、P10/2的响应值随着霉变程度的加深而增大，说明霉变后的黄精主要产生了更多的芳香族类化合物和烃类化合物。通过PLS-DA模型对电子鼻传感器进行初步优化，得到T70/2、T30/1、PA/2、P10/1、P40/1五根传感器对不同霉变程度的黄精分类贡献最大。对不同霉变程度黄精样品进行PCA、KNN、SMO、Random Forest、Native Bayes分类，找到了黄精霉变快速判别的最佳模型，即KNN模型（正判率高达97.2%）。
本研究基于电子鼻技术对黄精霉变前后的气味变化规律进行分析，解释了霉变前后黄精气味的差异，同时建立了黄精霉变的快速判别模型。黄精作为药食同源的优势中药材，需要保证其临床应用的安全有效，但是由于过多不可控的因素，霉变现象一直存在。所以本研究为中药黄精的预警系统的建立提供了技术支持，也为中药的霉变提供了理论基础。但对于霉变的发生机理、微生物的代谢与黄精霉变之间关联，以及黄精霉变过程品质的变化规律还需要继续研究，从而能够从根源上解决霉变现象的发生，保证用药的安全有效。
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