摘 要：目的 通过生物信息学方法构建原发性干燥综合征(primary Sjögren’s syndrome, pSS)患者唾液腺组织中的竞争内源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)调控网络并探讨其发病机制。方法 利用基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)对pSS患者唾液腺组织中的信使RNA(messenger RNA, mRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)表达谱作差异分析。通过miRcode数据库和3个miRNA数据库(TargetScan、miRDB和miRWalk)获取与pSS有关的靶微小RNA(microRNA, miRNA)和靶mRNA,构建lncRNA-miRNA-mRNA的ceRNA调控网络，对ceRNA网络中差异表达基因(differentially expressed mRNAs, DEmRNAs)进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析。结果 在ceRNA网络中有214个DEmRNAs。KEGG分析显示DEmRNAs的主要富集信号通路为丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)信号通路，DEmRNAs中10个枢纽(Hub)基因分别为JUN、CCND1、NRAS、DDX5、KAT2B、VEGFA、SIRT1、CLTA、MCM7和RPS6KA1。结论 本研究通过构建ceRNA调控网络，发现网络中DEmRNAs主要富集MAPK和AMPK信号通路，为进一步深入探讨原发性干燥综合征的诊断和治疗提供了新的思路。
关键词:原发性干燥综合征; ceRNA调控网络;生信分析;信使RNA;长链非编码RNA;微小RNA;
Construction and analysis of ceRNA network in salivary gland tissues of patients
with primary Sjogren'
S syndrome
WU Ling-ling LING Hua-yun ZHOU Ying QIU Lijuan WANG Hong XUE Yu CHEN
Hui-juan WANG Ting-rui WANG Bin
Department of Epidemiology and Health Statistics, School of Public Health, Anhui Medical
University, Inflammation and Immune Mediated Diseases Laboratory of Anhui Province
Abstract：
Objective The competing endogenous RNAs(ceRNA) regulation network in salivary gland tissues of patients with primary Sjögren’s syndrome(pSS) was constructed by bioinformatics methods and its pathogenesis was investigated. Methods Differential expression analyses of messenger RNA(mRNA) dataset and long non-coding RNA(lncRNA) dataset from salivary gland tissues of pSS patients were conducted based on GEO database. Target miRNA and target mRNA related to pSS were obtained through miRNA databases, and then lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA regulation network was constructed. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG) pathway enrichment analysis was performed for differentially expressed mRNAs(DEmRNAs) in the ceRNA regulation network. Results A total of 214 target mRNA were obtained in the ceRNA network. KEGG analysis of different genes in the network showed that the main gene enrichment pathway were mitogen-activated protein kinase(MAPK) signaling pathway and AMP-activated protein kinase(AMPK) signaling pathway. Hub gene JUN, CCND1, NRAS, DDX5, KAT2B, VEGFA, SIRT1, CLTA, MCM7 and RPS6KA1 were selected in pSS. Conclusion This study finds that the DEmRNAs in the ceRNA regulatory network mainly enriched in MAPK and AMPK signaling pathways, which provided a new idea for the diagnosis and treatment of primary Sjogren's syndrome.
Keyword：
Primary Sjögren’s syndrome; CeRNA regulation network; Bioinformatics analysis; Messenger RNA; Long non-coding RNA; MicroRNA ;
原发性干燥综合征(primary Sjögren’s syndrome, pSS)是一种慢性自身免疫性疾病，主要特征是淋巴细胞增殖和进行性外分泌腺体损伤(主要包括唾液腺和泪腺)[1]。其临床表现有较大的个体差异，从相对轻微的干燥症状、关节痛和疲劳可发展到严重的全身症状，甚至导致血管炎、肾小球肾炎和许多神经系统损伤[2,3]。pSS在中国人群的患病率为0.5%～1.0%,男女比例为1∶9。作为一种慢性复杂性疾病，pSS的发生是遗传和环境等多种因素共同作用的结果[4]。
微小RNA(microRNA, miRNA)是一类由长度约为22个核苷酸组成的非编码单链RNA,它主要通过识别信使RNA(messenger RNA, mRNA)上的miRNA反应元件(microRNA response element, MRE)调控mRNA翻译过程[5]。2011年，Selmena等[6]提出竞争内源性RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)假说，揭示了一种RNA间相互作用的新机制。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可作为ceRNA竞争吸附miRNA,进而导致miRNA表达水平降低和活性减弱，最终影响到mRNA的表达。已有生物信息学研究[7,8,9]表明，人类基因组中大多数与免疫相关的lncRNA含有miRNA识别位点，且lncRNA可以作为ceRNA参与免疫、炎症相关基因的表达调控，进而介导免疫和炎症反应过程。
近年来，有研究[10]发现pSS存在多种差异表达的lncRNA(differentially expressed lncRNAs, DElncRNAs)如LINC00657和LINC00511,lncRNA与pSS患者特异性免疫浸润模式相关[11],提示lncRNA可能在pSS的发病机制中发挥作用。 因此，本研究拟基于基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO),利用生物信息学方法构建pSS相关ceRNA网络，对lncRNA作为潜在ceRNA参与pSS发病机制进行初步探索，并结合文献讨论其在pSS发病机制研究中的意义。
1 资料与方法
1.1 资料来源
本研究数据集来源于GEO数据库(http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)。以“primary Sjögren’s syndrome”“pSS”为关键词，以“Expression profiling by array”为研究类型，以“Homo sapiens”为物种，检索数据集。数据集的纳入标准：(1)数据中必须包括病例组和对照组；(2)生物样本为唾液腺组织；(3)总样本数≥8个。最终，选取编号为GSE23117和GSE76013的数据集。
1.2 差异表达分析
首先利用Perl 5.34.0软件对数据集进行基因的重注释，删除其中不能识别或者重复的序列，然后采用R 4.0.2软件中“limma”包筛选pSS组和对照组差异表达的mRNAs(differentially expressed mRNAs, DEmRNAs)和DElncRNAs, 并通过“ggplot2”软件包绘制DEmRNAs的火山图和热图。当|log2FC(Fold Change)|≥1,FDR<0.05则认为两组间差异有统计学意义，log2FC≥1为上调基因，log2FC≤-1为下调基因。
1.3 ceRNA调控网络的构建
利用miRcode数据库提取DElncRNAs竞争结合的靶miRNA,将靶miRNA输入3个miRNA数据库(TargetScan、miRDB和miRWalk)查找其对应的靶mRNA,取靶mRNA和数据集GSE23117的DEmRNAs的交集，作为lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络中的mRNA,结合上述得到的DElncRNAs和靶miRNA,使用Cytoscape 3.4.0软件构建并可视化lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA调控网络。
1.4 DEmRNAs的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路富集分析
将ceRNA调控网络中的mRNA分为上调基因和下调基因两部分，利用Cytoscape 软件中“ClueGO”插件分别进行KEGG通路富集分析，并可视化分析结果。
1.5 蛋白质互作(protein-protein interaction, PPI)网络的构建和枢纽(Hub)基因的筛选
将DEmRNAs导入STRING工具(http: //www.string-db.org)后构建PPI网络，通过“cytohubba”中Degree算法计算PPI网络中蛋白连通度，选取排名前10位的基因为Hub基因。
2 结果
2.1 GEO数据集的基本信息
纳入研究的GEO数据集。见表1。
2.2 差异表达分析结果
mRNA数据集GSE23117得到上调基因758个，下调基因2 328个。lncRNA数据集GSE76013得到上调基因872个，下调基因322个。见图1。
2.3 ceRNA调控网络
使用miRcode数据库对数据集GSE76013中的1 194个DElncRNAs进行靶向预测，筛选出8 950个靶miRNA。再通过miRDB、miRTarBase和TargetScan三个数据库共同预测靶mRNA,筛选出1 936个靶mRNA。将靶mRNA与数据集GSE23117中的DEmRNAs取交集，最终得到214个目标mRNA。利用上述预测结果构建lncRNA-miRNA-mRNA ceRNA网络，网络中包括35个miRNA节点，113个lncRNA节点以及214个mRNA节点。见表2、表3、图2。
2.4 DEmRNAs的KEGG通路富集分析
使用ClueGo对ceRNA网络中的mRNA进行KEGG通路富集分析，结果显示，上调基因主要富集在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信号通路和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)信号通路。下调基因主要富集在AMPK信号通路和乳腺癌、志贺氏菌病、脊髓小脑性共济失调等疾病相关通路。见图3。
2.5 PPI网络和Hub基因
基于STRING数据库获得DEmRNAs的PPI网络，计算获取了10个Hub基因，分别为JUN、CCND1、NRAS、DDX5、KAT2B、VEGFA、SIRT1、CLTA、MCM7和RPS6KA1。关键基因间存在相互作用。见图4、图5。
3 讨论
当干燥综合征(Sjögren’s syndrome, SS)单独出现时可定义为pSS,而伴随其他疾病如系统性红斑狼疮、类风湿关节炎和系统性硬化症出现时，则被称为继发性干燥综合征(secondary Sjögren’s syndrome, sSS)[2]。目前，尽管在SS的诊断和治疗方面取得了一些进展，但其分子机制仍不清楚。
本研究发现，pSS患者与健康对照者mRNA和lncRNA的表达差异有统计学意义，这提示异常表达的mRNA和lncRNA可能参与了疾病的发生发展。通过构建ceRNA网络，筛选出了10个Hub基因，其中NRAS、KAT2B、VEGFA、SIRT1和CLTA在pSS患者中表达显著上调，JUN、CCND1、DDX5、MCM7和RPS6KA1表达显著下调。此前相关研究[12,13,14,15,16,17,18]显示NRAS、KAT2B和SIRT1与CD4+T淋巴细胞亚群有关。一般认为，辅助性T淋巴细胞1(T helper 1, Th1)在pSS患者中呈现高表达的状态，通过破坏患者的外分泌腺腺泡和腺体，对病程的发展产生了重要影响[19]。也有观点[20]认为，Th1和辅助性T淋巴细胞17(T helper 17, Th17)的免疫应答可能启动了pSS的发病机制，并产生干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)和肿瘤坏死因子等细胞因子加重了炎症反应。NRAS是RAS基因家族成员之一，同家族的还包括HRAS、KRAS[21]。有研究[12]表明HRAS和NRAS可以将Toll样受体(toll-like receptor, TLR)信号传输到CD4+T淋巴细胞中，从而启动Th1的分化。KAT2B(又称PCAF),是一种赖氨酸乙酰转移酶，其同源蛋白还包括KAT2A[22]。KAT2A/KAT2B可通过调节白细胞介素-2(interleukin 2, IL-2)和IFN-γ等关键细胞因子的转录来促进T淋巴细胞亚群分化，从而参与自身免疫性疾病的发展。敲除诱导型调节性T淋巴细胞(inducible regulatory T cell, iTreg)中的KAT2A和KAT2B,可造成小鼠体型变小，胸腺萎缩，导致其免疫紊乱甚至死亡[13,14]。SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD+)依赖性脱乙酰酶，既可以通过NAD+-Sirt1-Foxo1轴直接调节T淋巴细胞增殖和分化，尤其是Th1和Th17细胞因子的分泌；也可以通过代谢途径间接调控T淋巴细胞免疫应答过程[15,16,17,18]。SIRT1免疫调节功能对可能pSS发生和发展存在重要意义。VEGFA是一种血管生长的有效诱导剂，它对于血管的生成和发育至关重要，有研究[23,24,25]表明在pSS患者中，其病理性的血管新生与VEGFA相关。
通过对调控网络中的DEmRNAs进行KEGG富集通路分析，发现它们主要富集在MAPK信号通路和AMPK信号通路。MAPK信号通路是由一组丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成的，主要包括细胞外信号调节蛋白激酶1/2 通路、细胞外信号调节蛋白激酶5通路、c-Jun氨基末端激酶和(或)应激活化蛋白激酶通路和p38丝裂原活化蛋白激酶通路等4个分支通路[26]。MAPK信号通路可以被不同的细胞外和细胞内刺激(细胞因子，激素和各种细胞应激物等)激活，参与调节各种细胞活动，包括增殖、分化、衰老和凋亡。研究[27,28,29]表明，MAPK信号通路的异常活化与癌症、类风湿关节炎、阿尔茨海默病、多发性硬化症等疾病相关。在pSS小鼠模型中，发现唾液腺细胞中p38丝裂原活化蛋白激酶和c-Jun氨基末端激酶在被Toll样受体9激活后可以发生磷酸化，介导唾液腺细胞的自噬和凋亡[30]。AMPK也是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它作为新陈代谢调节因子，能够通过感知机体自身的能量变化来调节新陈代谢水平[31]。pSS唾液腺上皮细胞(salivary gland epithelial cells, SGECs)能够通过分泌脂联素抵抗IFN-γ诱导的凋亡，而阻断AMPK信号通路后，SGECs的抗凋亡能力则会被削弱，这表明AMPK信号通路在pSS的发病机制中发挥了重要作用[32]。
本研究基于GEO数据库和miRNA数据库，筛选出pSS的DEmRNAs和DElncRNAs, 并预测得到DElncRNAs的靶miRNA。通过构建ceRNA调控网络，最后确定了网络中的10个Hub基因以及显著富集的两个信号通路—MAPK和AMPK通路，为pSS的发病分子机制研究提供了新的思路，然而有待未来开展进一步实验性研究来验证具体的作用机制。
利益冲突无
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