摘 要：目的 研究连翘提取物（FSE）对脂多糖（LPS）诱导炎症的抑制作用，以及LPS诱导的RAW264.7细胞极化模型建立。方法 MTT法检测FSE和LPS对RAW264.7细胞的毒性作用；倒置显微镜检测不同浓度的FSE对LPS刺激后的细胞形态变化，酶标仪检测细胞上清液的一氧化氮（NO）生成量；荧光显微镜检测细胞内活性氧（ROS）和细胞凋亡的荧光强度；RT-PCR法检测巨噬细胞中iNOS、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、Arginase-1和CD206mRNA的表达水平。结果MTT结果发现FSE在50μg/mL浓度时无细胞毒性，LPS作用36h时，不同浓度FSE对LPS刺激的细胞形态变化和NO生成有抑制作用，同时FSE可以抑制LPS刺激后活性氧（ROS）的减少和细胞的凋亡，RT-PCR结果显示，用不同浓度（100、250、500、750ng/mL）LPS处理细胞24h，或者用500ng/mL浓度的LPS处理细胞不同时间后，RAW264.7细胞M1型标记基因（TNF-α、IL-1β、iNOS、IL-6）mRNA的表达水平明显升高，RAW264.7细胞M2型标记基因（IL-10、Arginase-1、CD206mRNA）mRNA的表达水平明显降低；FSE可降低LPS诱导的M1型标记基因mRNA的表达水平，升高M2型标记基因mRNA的表达水平。结论FSE可通过抑制RAW264.7细胞凋亡和促进RAW264.7细胞的极化来抑制LPS诱导的炎症反应。
关键词:连翘提取物(FSE); RAW264.7细胞; M1/M2亚型;炎症;凋亡;
Forsythia suspensa extract inhibits LPS-induced inflammation by regulating
macrophage apoptosis and polarization
LUO Fulong LI Wenju ZHONG Wu FAN Bei GUAN Dongyan WANG Fengzhong
WANG Qiong
Institute of Food Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences
Department of Emergency Medicine, the filiated Hospital of Southwest Medical University
Sichuan Rehabilitation Hospital
Abstract：
Objective We investigated the inhibitory effect of Forsythia suspensa extract (FSE) on lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation and establishment of an LPS-induced polarization model of RAW264.7 cells. Methods MTT assays were used to assess cytotoxic effects of FSE and LPS on RAW264.7 cells. Inverted microscopy was used to assess morphological changes of cells after stimulation with LPS and various concentrations of FSE. An enzyme marker was used to detect nitric oxide (NO) in culture supernatants. Fluorescence microscopy was used to detect intracellular reactive oxygen species (ROS) and apoptosis.; RT-PCR was used to detect iNOS expression in macrophages. iNOS, TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, Arginase-1, and CD206 mRNA expression was measured by RT-PCR. Results FSE was not cytotoxic at 50 μg/mL. At 36 h of LPS stimulation, various concentrations of FSE inhibited LPS-induced morphological changes, NO production, and FSE inhibited LPS-induced the reduction of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis. Expression of M1-type marker genes (TNF-α, IL-1β, iNOS, and IL-6) in RAW264.7 cells was significantly increased after treatment with various concentrations (100, 250, 500, and 750 ng/mL) of LPS for 24 h or with 500 ng/mL LPS for various times. The mRNA levels of M2 marker genes (IL-10, Arginase-1, and CD206) were significantly decreased in RAW264.7 cells. FSE decreased the expression of LPS-induced M1 marker genes and increased expression of M2 marker genes. Conclusions FSE inhibits LPS-induced inflammatory responses by inhibiting RAW264.7 cell apoptosis and promoting polarization.
Keyword：
Forsythia suspensa extract; RAW264.7 cells; M1/M2 subtype; inflammation; apoptosis;
炎症的发生发展是一个时刻变化的过程，主要通过自身免疫系统实现对机体的自我保护作用[1]。炎症反应在人体内普遍存在，不仅可以减轻和消除有害因子对人体的损伤，还可以促进后期的组织修复，但免疫系统的过度激活，会促使炎症因子的大量释放，形成“细胞因子风暴”[2]，发生严重的不良反应，甚至危及生命。
巨噬细胞作为炎症性疾病最主要的免疫防御细胞，可以释放促炎介质促进炎症因子的形成[3]。巨噬细胞的可塑性和功能极化作用在炎症反应中发挥着重要作用[4]，巨噬细胞在特定微环境下，可以发生M1和M2表型的转化，在炎症反应的早期，M1型巨噬细胞可以分泌多种促炎因子，如诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、肿瘤坏死因-α（TNF-α）、白细胞介素-12（IL-12）、IL-6、IL-1β等，通过增强其自身的抗原提呈能力来激活Ⅰ型免疫反应，引起组织细胞损伤阻止炎症反应进程。与之相反，M2型巨噬细胞可以分泌多种炎症抑制因子，如IL-10、IL-4、精氨酸激酶-1（Arginase-1）、CD206等，通过抑制炎症反应的发展，促进组织损伤的自我修复过程[5,6]。脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS) 可以模拟炎症反应的早期阶段，通过诱导M1型巨噬细胞的分化[7,8]，促进炎症的发生。
中药免疫调节在炎症过程中发挥着重要作用，其内在机制可能与巨噬细胞M1和M2表型的平衡有关。连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl.是木犀科连翘属植物，连翘果实作为中药在我国被广泛应用[9]，但连翘对巨噬细胞凋亡和极化的研究鲜有报道。因此，本研究采用LPS诱导体外培养RAW264.7巨噬细胞的极化模型，探讨了连翘提取物(FSE)对LPS诱导的巨噬细胞ROS和细胞凋亡，以及M1/M2型相关标志基因的影响，初步探讨FSE在巨噬细胞发挥抗炎作用的内在机制。
1 材料和方法
1.1 细胞
RAW264.7细胞（北京大学医学部医学实验中心提供，ATCC公司）。
1.2 主要试剂与仪器
连翘产自山西，购自北京太洋树康药业有限责任公司（批号2012054），经水提、浓缩、喷雾干燥、粉碎而成；DMEM培养基( Thermo Scientific，批号11965092) ；胎牛血清( Gibco，批号：10099141 )；LPS (Sigma公司，批号12880) ；一氧化氮检测试剂盒（碧云天，批号：S0021）；Hoechst33342（碧云天，批号：C1022）；DCFH-DA活性氧ROS荧光探针（索莱宝，批号：D6470）；MTT试剂盒（索莱宝，批号：M1020）；EASYspinPlus组织/细胞RNA快速提取试剂盒( 艾德莱，批号：RN28 )；反转录试剂盒（普洛麦格，批号：A5000）；NovoStart SYBR qPCR SuperMix Plus（novoprotein，批号：E096-01B）；RT-PCR引物（北京擎科生物科技有限公司）。
细胞培养箱（美国，Thermo公司，型号：Thermo 371）；酶标仪（美国，Molecular Devices公司，型号：spectra MAX190）；荧光倒置显微镜（日本，Olympus公司，型号：IX71）；RT-PCR扩增仪（美国ABI公司，型号：ABI 7500)；可见紫外分光光度计（上海尤尼柯公司，型号：WFZ UV-2100)；低温高速离心机（德国，Eppendorf公司，型号：5430R）。
1.3 实验方法
1.3.1 RAW264.7的培养与分组
RAW264.7细胞复苏后，以含10%胎牛血清的DMEM培养基，5%的CO2、37℃恒温培养箱培养细胞，每隔24 h观察细胞状态并换液和传代，取对数生长期细胞进行实验，以每毫升1×104个的细胞密度接种于96孔板，每孔100 μL；或以每毫升1×106个细胞密度接种于6孔板，每孔2 mL。接种24 h后进行实验，实验设置对照组，LPS组（500 ng/mL），加药组（6.25、12.5、25、50 μg/mL），首先加入不同剂量连翘提取物作用2 h，再每孔加入500 ng/mL的LPS溶液共同刺激36 h。
1.3.2 MTT法检测FSE和LPS对RAW264.7细胞的毒性作用
取处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板，加入不同浓度的FSE和LPS作用36 h，每孔加入10%的MTT溶液100 μL，培养4 h后，吸去孔内培养液。每孔加入110 μL二甲基亚砜，置摇床上低速震荡10 min，使结晶物充分溶解。490 nm检测各孔的吸光度。
1.3.3 倒置显微镜观察细胞形态
取处于对数生长期的RAW264.7细胞接种于96孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。然后加入LPS以及不同浓度FSE作用36 h，用倒置显微镜观察各组细胞形态变化。
1.3.4 细胞上清液一氧化氮（NO）生成量测定
取处于对数生长期的RAW264.7细胞密度接种于96孔板。药物处理36 h后，取各组细胞上清液50 μL分别加入Griess Reagent I和Griess Reagent II液各50 μL，酶标仪540 nm检测各组的吸光度。
1.3.5 细胞内活性氧( ROS )和细胞凋亡测定
将对数生长期的RAW264.7细胞，接种于6孔板中，药物处理完成后，加入1 mL稀释好的DCFH-DA或Hoechst33342溶液，稀释比例为1：1000，使其终浓度为10 μmol/L，置于37℃细胞培养箱内避光孵育30 min，用无血清培养基洗3次，荧光显微镜观察细胞形态并拍照，用Image-Pro Plus分析荧光强度。
1.3.6 总RNA的提取、mRNA的逆转录及RT-PCR
提取RNA方法参照试剂盒说明书进行，得到RNA溶液。按照逆转录试剂盒，以逆转录cDNA第一链合成，然后以cDNA为模板扩增目标基因的基因编码段，以鼠GAPDH为内参照，应用2－△△Ct法计算各基因的相对表达量。扩增条件如下：95℃预变性1 min；95℃变性20 s，60℃延伸1 min，40个循环。本实验所用引物由北京擎科生物科技有限公司从NCBI中获得，引物用 Primer 6 和 Oligo 7设计，并由北京擎科生物科技有限公司合成。（表1）
表1 RT-PCR引物序列
1.4 统计学方法
采用GraphPad Prism8.0软件对数据进行统计分析，结果以平均数±标准差 (x̅±s) 表示，2组间差异比较采用t检验，多组间差异比较采用单因素方差分析，P<0.05为具有显著性差异，P<0.01为具有极显著性差异。
2 结果
2.1 FSE和LPS对细胞活性的影响
实验结果显示，相比于对照组细胞，100、200 μg/mL浓度的FSE细胞活力分别为(67.13±3.25)%、(41.49±2.78)%，FSE浓度依赖性的抑制细胞增殖，在 FSE低于50 μg/mL的浓度处理下，FSE对细胞的增殖没有明显的抑制作用，细胞存活率没有显著性变化，故选用低于50 μg/mL浓度范围进行后续实验( 图1A )。相比于对照组细胞，LPS浓度在100 ng/mL到1500 ng/mL均对细胞的增殖没有明显的抑制作用( 图1B )。
2.2 FSE降低LPS诱导的RAW264.7细胞NO产生
为了研究FSE对LPS刺激RAW264.7细胞后的NO生成的影响，用不同浓度的LPS刺激细胞36 h。结果发现，与对照组相比，在500 ng/mL的LPS刺激细胞时，NO生成量最大，随着LPS浓度的增高，NO生成量逐渐下降（图2A）,故后续试验采用500 ng/mL的LPS作为诱导浓度。然后在500 ng/mL的LPS刺激下，研究了FSE对细胞NO生成量的作用。结果发现6.25、12.5、25、50 μg/mL浓度的FSE可以降低LPS刺激后细胞内NO生成量（图2B）。
2.3 FSE对LPS诱导后RAW264.7细胞形态的影响
倒置显微镜下观察到细胞生长状态，正常组的细胞是不规则的圆形；LPS组的细胞形态相对于正常细胞较大，长出不规则触角，变成梭形，细胞明显诱导贴壁；各给药组细胞形态均趋于正常，有部分细胞恢复为半贴壁的圆形细胞( 图3 )。
2.4 FSE对LPS诱导的细胞内ROS的影响
首先，在荧光显微镜下分别测得在3、6、12、24 h的绿色荧光强度。在500 ng/mL的LPS刺激RAW264.7细胞3~6 h时，荧光强度与对照组相比明显升高，但LPS刺激细胞24 h时，荧光强度与对照组相比明显减少（图4A）。再用12.5、25、50 μg/mL的FSE作用细胞24 h，与LPS组相比，FSE组荧光强度明显升高（图4B、4C）。
2.5 FSE对LPS诱导的细胞凋亡的影响
为了得到LPS刺激之后RAW264.7细胞的凋亡情况，在Hoechst33342染色的3、6、12、24 h分别在荧光显微镜下的蓝色荧光强度。结果发现，在24 h荧光强度差异最为明显（图5A）。接下来，用12.5、25、50 μg/mL的FSE作用24 h，与模型组相比，FSE组荧光强度明显下降（图5B、5C）。
2.5 FSE对LPS诱导的细胞凋亡的影响
为了得到LPS刺激之后RAW264.7细胞的凋亡情况，在Hoechst33342染色的3、6、12、24 h分别在荧光显微镜下的蓝色荧光强度。结果发现，在24 h荧光强度差异最为明显（图5A）。接下来，用12.5、25、50 μg/mL的FSE作用24 h，与模型组相比，FSE组荧光强度明显下降（图5B、5C）。
2.7 FSE对LPS诱导的细胞极化的影响
为了进一步研究FSE对细胞极化的调节作用，将FSE加入500 ng/mL的LPS刺激细胞36 h。结果显示，FSE可以降低LPS诱导上调的基因( IL-1β、IL-6、iNOS) mRNA表达水平，同时可以升高LPS诱导下调基因（CD206、IL-10）mRNA表达水平（图7）。
3 讨论
炎症反应在人体内普遍存在，参与了慢性阻塞性肺病、炎症性肠病、神经退行性疾病、心血管疾病、消化性疾病以及糖尿病等多种疾病的发生发展[9,10]。这些炎症性疾病给社会带来了相当大的经济负担，缩短了患者的平均预期寿命[11,12], 目前，非甾体抗炎药作为抑制炎症症状的常用药物，长期使用会产生胃肠道等各种副作用[13]，因此，迫切需要研究可靠、有效的替代药物来预防和治疗各种疾病。
连翘作为传统中药，具有抗炎、抑菌、抗病毒、抗肿瘤、神经系统保护等诸多作用。具有较大的临床药用价值，现已分离出300多种化学成分，包括苯乙醇苷类、木脂素类、酚酸类、黄酮类、萜类及挥发油、C6-C2天然醇及其苷类等[14]，其中主要化学成分为苯乙醇苷类和木脂素类[15]，目前分离得到苯乙醇苷类成分包括连翘酯苷A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、毛柳苷、车前草苷A、木通苯乙醇苷A、B等[16,17]。木脂素类成分主要包括连翘苷、连翘脂素、牛蒡子苷元、松脂素、表松脂素、落叶松脂素、异落叶松脂素、Cedrusin、连翘兰A、连翘兰B 、异橄榄脂素[18]，其中连翘酯苷A和连翘苷为2020版《中国药典》连翘含量测定的指标性成分[19]。连翘提取物均有抑制炎症反应的作用，其水提物、甲醇提取物、乙醇提取物以及挥发油等可以抑制多种炎症模型[20,21,22,23]，连翘各极性部位提取物的含量差别较大，其中水提取物提取率最高[24]，连翘提取物主要通过NF-κB信号通路、JAK/STAT信号通路、MAPK信号通路，调控炎症过程中的多种酶及炎性介质的产生[25]，从而抑制炎症反应。
活性氧（ROS）作为体内炎症反应的重要活性成分，主要由NADPH氧化酶( Nox )产生，通过激活下游信号级联反应来扩大炎症的二级信使[26,27]，ROS也可以过激活非特异性免疫系统消除病原体和修复损伤组织[28]，研究发现LPS可以促进ROS的产生[29]，本研究中，LPS在刺激RAW264.7细胞后3~6 h时，细胞内ROS大量产生，但是在LPS在刺激细胞24 h时，细胞内ROS产生减少，而FSE可以增加LPS刺激24 h时的ROS产生。
此外，ROS通过磷酸肌醇3-激酶( PI3K )/AKT途径触发多种细胞内反应[29]，调节细胞的凋亡过程[30]。ROS对巨噬细胞发挥双向调节作用，ROS既可以促进巨噬细胞的凋亡，又可以抑制巨噬细胞的凋亡，这可能与cAMP激活 cAMP依赖性蛋白激酶有关[31]。在LPS诱导24 h时，ROS的产生量显著减少，RAW264.7细胞凋亡显著增加。FSE可以增加LPS刺激24 h时的ROS产生量，并且减少LPS刺激24 h时的细胞凋亡，FSE发挥抗炎作用可能是通过增加巨噬细胞内的ROS，抑制其自身细胞的凋亡，进而发挥巨噬细胞的免疫调节功能。
近年来，巨噬细胞的极化参与多种疾病过程的调节，如免疫性神经炎[32]、炎症性肠病[33]、糖尿病和肥胖症[34]、类风湿性关节炎[35]等，巨噬细胞的极化可以通过LPS诱导为M1型或者通过IL-4诱导为M2型巨噬细胞[36,37]，本文研究了LPS诱导的RAW264.7细胞极化的模型，在不同浓度的LPS以及LPS作用不同时间中，M1和M2表型的基因表达水平存在差异，为RAW264.7细胞极化的模型提供了一种新思路。进一步研究发现FSE可显著降低LPS诱导RAW264.7细胞M1表型IL-1β、iNOS、IL-6 mRNA表达水平，FSE同时明显升高M2表型CD206、IL-10 mRNA 表达水平，以发挥抗炎的作用。
综上所述，FSE可通过抑制RAW264.7细胞的凋亡以及促进M2型巨噬细胞的表达，从而抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应，从细胞凋亡和巨噬细胞极化功能角度进一步阐明连翘发挥抗炎作用的内在机制，对其临床应用提供了很好的参考。
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