摘 要：
目的 观察银杏叶提取物联合尼麦角林对急性缺血性脑卒中(AIS)患者Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-核因子-E2相关因子(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号传导通路的影响。方法 将136例AIS患者按随机数字表法分为试验组68例与对照组68例。对照组给予尼麦角林片20 mg,每天2次，口服；试验组在对照组基础上给予银杏叶提取物注射液15 mL+0.9%NaCl 250 mL,静脉滴注，每天1次。2组治疗时间均为14 d。于治疗前后用改良Rankin量表(mRS)及美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评估2组的生活能力及神经功能；用颈动脉彩超检查评价患者颈动脉-中膜厚度(IMT)、颈动脉斑块面积；用Western blot法检测患者外周中醌氧化还原酶1(NQO1)、Keap1、Nrf2、ARE蛋白水平，观察治疗期间的药物不良反应及预后情况。结果 治疗后，试验组及对照组NQO1蛋白水平分别为1.23±0.26,0.89±0.16,Keap1蛋白水平分别为1.08±0.19,1.58±0.24,Nrf2蛋白水平分别为1.10±0.24,0.84±0.20,ARE蛋白水平分别为1.13±0.24,0.80±0.14,IMT水平分别为(0.64±0.09),(0.80±0.13)mm,斑块面积分别为(0.40±0.10),(0.63±0.16)mm2,NIHSS评分分别为(3.75±1.53),(4.30±1.38)分，mRS评分分别为(1.29±0.40),(1.89±0.60)分，差异均有统计学意义(均P<0.05)。试验组和对照组的复发率分别为1.47%(1例/68例),13.24%(9例/68例),预后不良发生率分别为1.47%(1例/68例),11.76%(8例/68例),差异有统计学意义(P<0.05)。试验组出现轻微皮疹3例(4.41%),胃肠道不适1例(1.47%),血压降低1例(1.47%);对照组出现潮热1例(1.47%),恶心1例(1.47%),轻微皮疹2例(2.94%),差异无统计学意义(P>0.05)。结论 银杏叶提取物联合尼麦角林治疗AIS疗效确切，利于患者神经功能及预后质量的优化，这可能与银杏叶提取物辅助治疗可改善Keap1-Nrf2/ARE信号传导通路蛋白的异常表达有关。
关键词：
银杏叶提取物 尼麦角林 急性缺血性脑卒中
Clinical trial of Ginkgo biloba extract combined with nicergoline in patients with acute ischemic stroke
SONG Qiu-ying TAO Chen-juan
Department of Neurology,Affiliated Hospital of Hangzhou Normal University;
Abstract：
Objective To investigate the effect of Ginkgo biloba extract combined with nigergoline on Kelch-like epichlorohydrin-related protein-1(Keap1)-nuclear factor-E2-related factor(Nrf2)/antioxidative response element(ARE) signaling in patients with acute ischemic stroke Impact of the pathway. Methods A total of 136 patients with AIS were divided into treatment group and control group according to the random number table method, 68 cases in each group. Control group was treated with nicergoline tablets 20 mg, twice a day, orally. Treatment group was treated with Ginkgo biloba extract injection 15 mL + 0. 9% Na Cl 250 m L intravenous drip,once a day,on the basis of control group. The treatment time of both groups was 14 d. The modified Rankin Scale( mRS) and the National Institute of Health stroke scale( NIHSS) were used to evaluate the independent living ability and nerve function in two groups; carotid color doppler ultrasound was used to evaluate the carotid-media thickness( IMT) and carotid plaque area of patients; Western blot was used to detect peripheral quinone oxidoreductase 1( NQO1),Keap1,Nrf2,ARE protein level. The adverse drug reactions occurred during the treatment and the follow-up in two groups were observed. Results After treatment,the levels of NQO1 protein were 1. 23 ± 0. 26,0. 89 ± 0. 16,Keap1 protein levels were 1. 08 ± 0. 19,1. 58 ± 0. 24,Nrf2 protein levels were 1. 10 ± 0. 24,0. 84 ± 0. 20,ARE protein levels were 1. 13 ± 0. 24,0. 80 ± 0. 14,the IMT were( 0. 64 ± 0. 09),( 0. 80 ± 0. 13) mm,the plaque area were( 0. 40 ± 0. 10),( 0. 63 ± 0. 16) mm2,the NIHSS scores were 3. 75 ± 1. 53,4. 30 ± 1. 38,mRS were 1. 29 ± 0. 40 and 1. 89 ± 0. 60,all with significant differences( all P < 0. 05). The recurrence rates in treatment group and control group were 1. 47%( 1 case/68 cases),13. 24%( 9 cases/68 cases),and the incidence of poor prognosis were 1. 47%( 1 case/68 cases) and 11. 76%( 8 cases/68 cases),with statistically significant difference( P < 0. 05). There were 3 cases of mild rash( 4. 41%),1 case of gastrointestinal discomfort( 1. 47%),1 case of hypotension( 1. 47%) in treatment group,and there were 1 case of hot flashes( 1. 47%),1 case of nausea( 1. 47%),2 cases of rash( 2. 94%) in control group,without significant difference( P > 0. 05).Conclusion Ginkgo biloba extract combined with nigergoline is effective in treating patients with AIS,which is beneficial to the optimization of neurological function and prognosis quality of patients. This may be related to the fact that adjuvant treatment with Ginkgo biloba extract can improve the abnormal expression of Keap1-Nrf2/ARE signaling pathway proteins.
Keyword：
Ginkgo biloba extract; nigergoline; acute ischemic stroke;
急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke, AIS)是目前世界上导致人类残疾的首要原因，多认为其发病机制是血管粥样硬化和血栓形成所致，与氧化应激、炎症机制、代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性及自由基与凋亡等均密切相关[1]。尼麦角林属麦角碱类衍生物制剂，在临床上广泛用于治疗脑梗死和其他脑缺血性疾病[2]。银杏叶提取物有效成分主要为黄酮苷类、银杏内酯、白果内酯，其对修复和增加缺血部位脑血管数量方面具有重要作用[3]。本研究旨在探讨银杏叶提取物联合尼麦角林对AIS患者Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)-核因子-E2相关因子(Nrf2)/抗氧化反应元件(ARE)信号传导通路的影响。
材料、对象与方法
1 研究设计
方案按前瞻性、随机、单盲、阳性药对照、单中心临床研究方法设计。
2 研究对象
入选2018年4月至2019年6月于杭州师范大学附属医院就诊的AIS患者136例为研究对象。方案经杭州师范大学附属医院伦理委员会批准。受试者均签署知情同意书。
诊断与入选标准 均符合AIS相关诊断标准[4]。①TOAST分型为小动脉闭塞性卒中型及大动脉粥样硬化性卒中型；②未对银杏叶提取物或尼麦角林中任何成分过敏，且无影响药物吸收疾病者；急性起病，且发病至入组时间<48 h; ③未合并急性或慢性感染或其他恶性肿瘤疾病；④临床资料完整。
排除标准 ①伴有急性出血、严重心动过缓等其他不宜使用尼麦角林片的情况者；②既往存在脑外伤及脑卒中病史；③合并凝血功能障碍、重要脏器(如心、肺等)严重功能不全者；④研究者认为存在不能入选研究的其他原因；⑤有出血倾向或血液病者。
3 药品、试剂与仪器
尼麦角林片，规格：每片5 mg, 批号：20180627,批准文号：H20000482,昆山龙灯瑞迪制药有限公司生产；银杏叶提取物注射液，规格：每支5 mL/17.5 mg, 批号：20181014,批准文号：H20070226,悦康药业集团有限公司生产。Focollhypzue细胞分离液，碧云天生物技术公司产品；BCA蛋白浓度测定试剂盒，NQO1、Keap1、Nrf2、ARE单克隆抗体，均购自美国贝克曼库尔特有限公司。
JH-910全数字彩色多普勒超声波诊断仪，江苏佳华电子设备有限公司产品；Sub-Cell Model 96Cell水平电泳仪；Gel Doc XR+凝胶成像仪，均为美国Bio-Rad公司产品。
4 分组与治疗方法
将患者按随机数字表法随机分为试验组68例与对照组68例。参照2014中国缺血性脑卒中诊治指南，给予抗血小板、控制血压、营养支持和改善微循环等常规治疗，并给予尼麦角林片，每次20 mg, 每天2次，口服。在对照组基础上，试验组给予银杏叶提取物注射液15 mL+0.9% NaCl 250 mL,静脉滴注，每天1次。2组治疗时间均为14 d。
5 观察指标
Keap1-Nrf2-ARE信号通路相关蛋白水平[5] 用Western blot法检测，于治疗前后采集患者的晨起空腹外周静脉血2 mL。外周血加入红细胞裂解液200 μL,冰上放置30 min后，4 ℃下以1.2×104 r·min-1离心，收集上清液为细胞裂解液。用BCA法进行蛋白定量，即为RIPA提取蛋白，以分离胶120 V、浓缩胶80 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳垂直电泳分离，上样量为每孔30 μg, 转移蛋白质至PVDF膜，并加入相应的一抗，4 ℃下孵育过夜，PBS洗涤3次后，加入1∶3000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗鼠或抗兔的二抗室温孵育过夜，然后以PBS洗涤液洗涤3次，每次10 min, 化学发光增强法显色。用Image J软件分析目的条带的灰度值。
颈动脉彩超检查[6] 于治疗前后进行颈动脉彩超检查，检测颈动脉-中膜厚度(IMT)及颈动脉斑块面积。
神经功能和独立生活能力[7] 于治疗前后用美国国立卫生研究院卒中量表(NIHSS)评价患者缺损情况，分数越高提示神经受损越严重；用mRS评分评估患者独立生活能力，分数越高提示预后越差，评价工作均由2位5年以上临床工作经验的康复医师共同完成。
安全性评价 患者出院后对其进行为期3个月的有效随访，主要包括电话随访、家庭随访或门诊随访等方式，主要观察患者脑出血发生情况及转氨酶、肌酶异常情况。
预后质量 观察的主要终点事件为3个月内卒中复发或者死亡，其中复发定义为患者在出院后再次经影像学检测明确存在新发缺血灶。次要终点事件包括3个月内mRS评分变化情况，将mRS评分>2分者定义为预后不良。
6 统计学处理
数据用SPSS 22.0软件进行统计分析。计量资料用x¯±s表示，组间比较用t检验；计数资料用率(%)表示，用χ2检验比较。
结 果
1 一般资料
2组患者的一般资料比较，差异均无统计学意义(均P>0.05),见表1。
表1 2组一般资料比较(x¯±s)
2 2组Keap1-Nrf2-ARE信号通路相关蛋白水平比较
治疗前，2组NQO1蛋白、Keap1蛋白、Nrf2蛋白、ARE蛋白水平比较，差异均无统计学意义(均P>0.05);治疗后2组以上蛋白表达差异均有统计学意义(均P<0.05),见表2。
表2 2组Keap1-Nrf2-ARE信号通路相关蛋白水平比较(x¯±s)
3 2组颈动脉彩超检查结果比较
治疗前，试验组及对照组IMT水平分别为(1.03±0.19),(1.08±0.19)mm, 斑块面积分别为(0.84±0.24),(0.88±0.20)mm2,差异无统计学意义(P>0.05);治疗后，试验组及对照组IMT水平分别为(0.64±0.09),(0.80±0.13)mm, 斑块面积分别为(0.40±0.10),(0.63±0.16)mm2,差异均有统计学意义(均P<0.05)。
4 2组神经功能和独立生活能力比较
治疗前，试验组及对照组NIHSS和mRS评分差异无统计学意义(P>0.05);治疗后，试验组及对照组NIHSS和mRS评分，差异均有统计学意义(均P<0.05),见表3。
表3 2组神经功能和独立生活能力比较(x¯±s)
5 2组预后质量比较
为期3个月的有效随访结果显示，2组患者均无死亡，差异无统计学意义(P>0.05)。试验组和对照组的复发率分别为1.47%(1例/68例),13.24%(9例/68例),预后不良发生率分别为1.47%(1例/68例),11.76%(8例/68例),差异有统计学意义(P<0.05)。
6 安全性评价
在随访期间，2组均未见继发脑出血，复查血清肌酸酐、转氨酶、肌酸磷酸酶均未见明显异常。试验组出现轻微皮疹3例(4.41%),胃肠道不适1例(1.47%),血压降低1例(1.47%);对照组潮热1例(1.47%),恶心1例(1.47%),轻微皮疹2例(2.94%),差异无统计学意义(P>0.05)。所有受试者均予以对症处理后症状消失。
讨 论
本研究结果示，银杏叶提取物联合尼麦角林治疗可通过抑制机体Keap1蛋白的表达，并促进Nrf2、ARE、NQO1蛋白的表达，继而改变Keap1-Nrf2/ARE信号传导通路。分析原因可能与银杏叶提取物中的有效成分银杏内酯[8]、白果内酯[9]可保护机体免受氧自由基伤害有关，但其具体作用机制仍需进一步深入研究。
本研究发现，联合治疗较单一用药更能有效减轻患者脑损伤程度，改善其神经功能及生活质量，临床疗效确切。认为银杏叶提取物与尼麦角林均具有恢复血脑屏障正常结构并改善脑内供血、保护脑组织内环境等效应，可发挥一定协同作用，明显提高临床治疗效果。本研究对所纳入的所有AIS患者用药安全性进行观察，发现2组均未见继发脑出血，复查血清肌酸酐、转氨酶、肌酸磷酸酶均未见明显异常。提示对于AIS患者而言应优先选择联合用药，而不是增加药物剂量或延长治疗周期。此外，本研究亦发现，银杏叶提取物联合尼麦角林治疗能够相对降低AIS患者复发及次要终点事件的发生率。
参考文献
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