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薄荷-荆芥不同配伍组分体外抗流感病毒作用研究

来源:搜集整理   日期:2021-05-08   点击数:

  摘    要:目的: 检测薄荷-荆芥不同配伍组分含药血清体外对甲型流感病毒的抑制作用。方法: 通过含药血清对MDCK细胞毒性的测定,计算含药血清的最大无毒剂量;通过CPE法测定甲型流感病毒TCID50,采用Reed-Muench氏法计算甲型流感病毒的TCID50,对流感病毒感染性进行测定;再运用MTT法观察薄荷-荆芥不同组分配伍组合含药血清对甲型流感病毒增值的抑制作用。结果: 以薄荷挥发油-薄荷黄酮-荆芥黄酮、荆芥挥发油-薄荷黄酮-荆芥黄酮、薄荷挥发油-荆芥挥发油-荆芥黄酮不同比例配伍组分对病毒增殖的抑制作用最为明显。结论: 薄荷-荆芥不同配伍组分含药血清体外可以抑制流感病毒在细胞内增殖,由此可证实薄荷-荆芥作为核心药对,其不同组分配伍具有确切的抗流感病毒作用。
  
  关键词:薄荷; 荆芥; 流感病毒; 含药血清; MDCK细胞; MTT法;
  
  Studies on the Anti-influenza Virus Effect in Vitro of Different Compatibility of Mentha haplocalyx-Schizonepeta
  
  SHU Ya-chun WANG Hai-dan ZHU Xuan-xuan SUN Qi-ran LI Wei-dong LU Tu-lin
  
  Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine/Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine Nanjing University of Chinese Medicine
  
  Abstract:Objective: To detection the action on influenza virus A in vitro of different compatibility of Mentha haplocalyx – Schizonepeta. containing serum. Methods: By measuring the toxicity of containing serum to MDCK cells, the maximum non-toxic dose of containing serum was calculated. TCID50 of influenza A virus was determined by CPE method, and TCID50 of influenza A virus was calculated by Reed-Muench method to determine the infectivity of influenza virus. Finally, MTT assay was used to observe the inhibitory effect of different compatibility of Mentha haplocalyx – Schizonepeta. containing serum on the proliferation of influenza A virus. Results: It is the most obvious that the inhibition of virus proliferation on different combinations of the components ratio volatile oil and flavonoids in Mentha haplocalyx and Schizonepeta. Conclusion: Different compatibility of Mentha haplocalyx – Schizonepeta containing serum inhibit influenza virus replication in vitro, and it can be proved that Mentha haplocalyx and Schizonepeta, as the key drug pairs, have a definite anti - influenza virus effect.
  
  Keyword:Mentha haplocalyx; Schizonepeta; influenza virus; containing serum; Madin-Darby canine kidney cells(MDCK cells); MTT assay;
  
  流感是首个全球监控的严重威胁人类健康的急性传染病,中医药是防治流感的重要手段[1]。中药及其复方治疗流感副作用小,具有独特的临床疗效,具有广阔的研究与应用前景。
  
  薄荷、荆芥分别具有良好的抗流感病毒作用,是临床常用中药,两药作为传统经典药对应用广泛,作为核心药对发挥着重要作用,代表性方剂如荆芥汤、荆芥散、荆防散、银翘散、荆芥薄荷汤、荆防败毒散、薄荷白檀汤[2]等。在现代中医临床实践中,以薄荷-荆芥药对组成的中药复方或中成药应用也非常广泛,如感冒舒、感冒清热颗粒、银翘解毒片等对流感呼吸道病毒均有明显的抑制作用,具有良好的临床疗效[3]。现代研究表明,挥发油类和黄酮类成分是薄荷、荆芥的主要有效组分,具有抗炎镇痛、抗病毒等作用[4,5,6,7]。本课题组在前期薄荷-荆芥不同配伍组分体内抗流感病毒作用研究的基础上,探讨薄荷挥发油、荆芥挥发油、薄荷黄酮、荆芥黄酮不同组分配伍后对体外抗甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1)作用。从而为加强薄荷-荆芥抗流感病毒作用药效组分、配伍关系和作用机制的研究提供依据。
  
  1 材料
  
  1.1 药品与试剂
  
  荆芥(南京松龄中药饮片有限公司,由江苏省中医院朱育凤教授鉴定为唇形科植物荆芥SchizonepetatenuifoliaBriq.的干燥全草);大孔树脂D101(翼飞雪生物科技公司,批号20160504);聚酰胺(30~60目)(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂,批号20160704);无水硫酸钠(南京化学试剂有限公司;批号:11030920190);其他试剂均为分析纯。
  
  薄荷挥发油:分别称取干燥的薄荷饮片1000g,置于10L的圆底烧瓶中,加6000mL水与玻璃珠数粒,振摇混合后,按2015年版《中国药典》(四部)挥发油提取装置[8]提取5h,得到浅黄色油状物,加入少量无水Na2SO4,静置1h,离心5min(3000r·min-1),去除多余水分,得到薄荷挥发油,放置适宜容器中,置-20℃冰箱保存。如上法,反复多次提取,得到一定量的薄荷挥发油。
  
  荆芥挥发油:分别称取干燥的荆芥饮片1000g,置于10L的圆底烧瓶中,加6000mL水与玻璃珠数粒,如上薄荷挥发油提取方法,反复多次提取,得到一定量的荆芥挥发油。
  
  薄荷黄酮:取上述装有提取过挥发油薄荷饮片的圆底烧瓶,加入5000mL80%乙醇,振摇混匀后,连接冷凝管,加热回流提取1.5小时,药液倒入另一专用容器,如此提取2次,合并提取液。用旋转蒸发仪进行旋转蒸发,浓缩至400mL。提前处理好聚酰胺层析柱,将400mL薄荷醇提浓缩液进行上样,待其吸附4小时后,先用水冲洗8个柱体积,再用20%乙醇冲洗6个柱体积至漏液颜色较浅时,用90%乙醇洗脱,接收漏液,旋转蒸发浓缩至10mL,置适宜容器冷冻干燥5天,精确称重即得薄荷黄酮。
  
  荆芥黄酮:取上述装有提取过挥发油荆芥饮片的圆底烧瓶,加入5000mL80%乙醇,振摇混匀后,连接冷凝管,加热回流提取1.5小时,药液倒入另一专用容器,如此提取2次,合并提取液。旋转蒸发浓缩至400mL。将400mL荆芥醇提浓缩液加入预处理好的D101大孔树脂动态吸附,待其吸附4小时后,先用水冲洗8个柱体积,再用20%乙醇冲洗6个柱体积至漏液颜色较浅时,用80%乙醇洗脱,接收漏液,旋转蒸发浓缩至10mL,置适宜容器冷冻干燥5天,精确称重即得荆芥黄酮。
  
  磷酸奥司他韦胶囊(达菲):由意大利RocheS.P.A生产,上海罗氏制药有限公司分装,产品批号:M1035,分装批号:SH0068。
  
  不完全MEM培养基(南京凯基生物技术有限公司提供,批号:20180830);0.25%(W/V)Trypsin-0.53MmEDTA(南京凯基生物技术有限公司提供,批号:20180724);PBS(南京凯基生物技术有限公司提供,批号:20180823);进口胎牛血清(Gibco公司,LOT:1828728);二甲亚砜(南京化学试剂有限公司,批号:10081010830);MTT(美国amresco公司,批号:29893)。
  
  1.2实验用仪器
  
  CO2培养箱(BB16)(Beraeus公司);倒置显微镜(XSZ-D2)(重庆光学仪器厂);0.22um微孔滤膜(美国Millipore公司);细胞培养板(美国corning公司);净化工作台(SW-CJ-1F)(苏州安泰空气技术有限公司);Synergy2多功能酶标仪(美国BioTek公司)。
  
  1.3实验用病毒株及细胞株
  
  细胞株:狗肾传代细胞(MDCK)由南京凯基生物技术有限公司提供;病毒株:甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1)由中国预防医学科学院病毒研究所提供,鸡胚接种传代,鸡红细胞凝集试验测得效价均为1:320。
  
  1.4药物及试剂配制
  
  0.5%羧甲基纤维素钠溶液:精密称取2.5g羧甲基纤维素钠,加蒸馏水至500ml,混匀,配制为0.5%羧甲基纤维素钠溶液。
  
  薄荷黄酮溶液:精密称取薄荷黄酮粉末100mg,加0.5%羧甲基纤维素钠溶液至20ml,混匀,配制为5mg/ml的薄荷黄酮溶液;荆芥黄酮溶液:精密称取荆芥黄酮粉末100mg,加0.5%羧甲基纤维素钠溶液至20ml,混匀,配制为5mg/ml的荆芥黄酮溶液,备用。
  
  一号药(薄荷挥发油-荆芥挥发油溶液):取2.5ml薄荷挥发油和2.5ml荆芥挥发油,加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成一号药溶液;二号药(薄荷挥发油-薄荷黄酮-荆芥黄酮溶液):取2.5ml薄荷挥发油和2.5ml薄荷黄酮和2.5ml荆芥黄酮溶液,加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成二号药溶液;三号药(荆芥挥发油-薄荷黄酮-荆芥黄酮溶液):取2.5ml荆芥挥发油和2.5ml薄荷黄酮和2.5ml荆芥黄酮溶液,加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成三号药溶液;四号药(薄荷挥发油-荆芥挥发油-薄荷黄酮溶液):取1.25ml薄荷挥发油,1.25ml荆芥挥发油和5ml薄荷黄酮溶液,加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成四药号溶液;五号药(薄荷挥发油-荆芥挥发油-荆芥黄酮溶液):取1.25ml薄荷挥发油,1.25ml荆芥挥发油和5ml荆芥黄酮溶液,加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成五号药溶液;六号药(薄荷挥发油-荆芥挥发油-薄荷黄酮-荆芥黄酮溶液):取1.25ml薄荷挥发油,1.25ml荆芥挥发油,2.5ml薄荷黄酮和2.5ml荆芥黄酮溶液,加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成六号药溶液;七号药(荆芥挥发油):取5ml荆芥挥发油加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成七号药溶液;八号药(薄荷挥发油):取5ml薄荷挥发油加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成八号药溶液。以上一至八号药液均按1ml/100g灌胃给药。
  
  磷酸奥司他韦胶囊溶液(达菲):规格:75mg/粒,取5粒胶囊加入0.5%羧甲基纤维素钠至100ml,配成磷酸奥司他韦胶囊溶液,按1ml/100g灌胃给药。
  
  MTT:精密称取MTT250mg,加入50mlPBS中,电磁力搅拌机上30min,用0.22µm微孔滤膜过滤除菌,4℃保存,两周内有效。
  
  1.5实验动物
  
  SPF级SD大鼠:体质量180~220g,由南通大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK(苏)2014-0001。
  
  1.6统计学处理
  
  统计学处理数据用`x±s表示,采用t检验,用spss18.0统计软件进行统计分析。实验采用Reed-Muench法计算病毒TCID50和药物抗病毒IC50。
  
  2 实验方法和结果
  
  2.1含药血清的制备
  
  将健康SD大鼠,按体质量随机分为10组,每组5只。分别为空白组、磷酸奥司他韦胶囊溶液组、一号药组至八号药组,每次按1ml/100g灌胃,一天两次,连续给药7天。最后一次按照两倍剂量给药,于末次给药1h后,10%水合氯醛麻醉大鼠,腹主动脉无菌取血,静置2h后,3000r/min离心10min,吸取血清。同组血清合并,经56℃,30min灭活,0.22µm微孔滤膜过滤除菌,0.5ml/支分装,置-80℃冰箱保存备用。
  
  2.2 MDCK细胞的培养
  
  取已长满的MDCK细胞,倒掉瓶内培养液,用PBS溶液冲洗两次,加入适量消化液消化,显微镜下观察。当细胞出现圆缩,细胞内间隙增大时,立即终止消化,用吸管反复吹打瓶壁细胞,形成单细胞悬液,收集细胞液离心,弃去上清液,加入含10%胎牛血清MEM培养液,按1:2或1:3比例接种到新的培养瓶内,37℃,5%CO2培养,备用。
  
  2.3含药血清对MDCK细胞毒性的测定
  
  将长成单层MDCK细胞的96孔培养板,弃去旧培养液。①正常细胞对照组:加入不含药物的MEM完全培养液。②阳性药组:用含10%胎牛血清MEM培养液将磷酸奥司他韦胶囊含药血清稀释,分别稀释成40%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%的浓度,每个浓度6个孔,每孔0.15ml。③含药血清:用含10%胎牛血清MEM培养液将一至八号药的含药血清、正常对照组含药血清稀释成40%、20%、10%、5%、2.5%、1.25%、0.6%、0.3%的浓度,每个浓度6个孔,每孔0.15ml加入培养板。将培养板移入37℃,5%CO2培养箱中培养。并在72h后采用MTT染色法,用酶标仪测定波长490nm处各孔OD值。结果见表1-表10。
  
  表1 MTT法观察正常组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=6)
  
  实验结果所示:正常组含药血清OD值与正常细胞比较,无显著性差异。
  
  表2 MTT法观察一号药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=5)
  
  实验结果所示:浓度为40%、20%、10%的含药血清OD值与正常细胞比较有显著性差异(P<0.01)。提示:一号药组对MDCK细胞最大无毒血清浓度为5%。
  
  表3 MTT法观察二号药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=5)
  
  实验结果所示:浓度为40%、20%、10%、5%的含药血清OD值与正常细胞比较有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。提示:二号药组对MDCK细胞最大无毒血清浓度为2.5%。
  
  表4 MTT法观察三号药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=6)
  
  实验结果所示:浓度为40%、20%、10%、5%的含药血清OD值与正常细胞比较有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。提示:三号药组对MDCK细胞最大无毒血清浓度为2.5%。
  
  表5 MTT法观察四号药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=6)
  
  实验结果所示:浓度为40%的含药血清OD值与正常细胞比较有显著性差异(P<0.05)。提示:四号药组对MDCK细胞最大无毒血清浓度为20%。
  
  表6 MTT法观察五号药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=5)
  
  实验结果所示:浓度为40%、20%的含药血清OD值与正常细胞比较有显著性差异(P<0.01)。提示:五号药组对MDCK细胞最大无毒血清浓度为10%。
  
  表7 MTT法观察六号药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=6)
  
  实验结果所示:浓度为40%、20%、10%的含药血清OD值与正常细胞比较有显著性差异(P<0.01)。提示:六号药组对MDCK细胞最大无毒血清浓度为5%。
  
  表8 MTT法观察七号药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=6)
  
  实验结果所示:浓度为40%、20%、10%的含药血清OD值与正常细胞比较有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。提示:七号药组对MDCK细胞最大无毒血清浓度为5%。
  
  表9 MTT法观察八号药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=5)
  
  实验结果所示:浓度为40%、20%、10%的含药血清OD值与正常细胞比较有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。提示:八号药组对MDCK细胞最大无毒血清浓度为5%。
  
  表10 MTT法观察阳性药组血清对MDCK细胞毒性的影响(n=5)
  
  实验结果所示:浓度为40%、20%、10%的含药血清OD值与正常细胞比较无显著性差异,但OD值有下降趋势。
  
  2.4甲型流感病毒A/PR8/34(H1N1)TCID50测定
  
  将长成单层MDCK细胞的96孔培养板,弃去旧培养液。将冻存的甲型流感病毒液快速冻融后,用完全培养液按10倍稀释成10-1~10-7的不同稀释度,接种到MDCK细胞培养板中,每个浓度8个孔,每孔接种200μl病毒液,置于37℃, 5%CO2培养箱中静置培养,2小时后,吸出病毒液,PBS洗涤两次,加入含有1ug/ml TPCK胰酶的培养基,置于37℃,5%CO2培养箱中静置培养。同时设细胞对照,倒置显微镜下观察细胞的形态及变化,以CPE不再进展时(48小时内)按Reed-Muench氏法计算病毒滴度,即该病毒的TCID50。用CPE法测定甲型流感病毒结果,见表11,图1。
  
  表11 CPE法测定甲型流感病毒TCID50结果
  
  用Reed-Muench氏法计算甲型流感病毒TCID50,结果见表12。
  
  表12 Reed-Muench氏法计算甲型流感病毒TCID50结果
  
  2.5 MTT法观察薄荷-荆芥不同组分配伍组合含药血清对甲型流感病毒增值的抑制作用
  
  取已长成单层的细胞,弃去上清。除正常细胞对照组外,其余均接种10TCID50的甲型流感病毒液,37℃,5%CO2培养箱中吸附2h后,弃去病毒液。①正常细胞组:不感染病毒,不加入药物血清,只加入含10%胎牛血清的MEM培养液。②病毒对照组:感染病毒,不加入药物,只加入含10%胎牛血清的MEM培养液。③正常对照组:加入2.5%正常对照组含药血清。④含药血清组:加入9个不同配伍的2.5%浓度的含药血清。⑤阳性药组:加入2.5%浓度的磷酸奥司他韦胶囊溶液含药血清。各组均设6个复孔,每孔0.2ml。37℃,5%CO2培养箱中培养,连续观察。当空白对照组CPE为“-”,病毒组CPE达“++++”时,终止培养,采用MTT染色法,用酶标仪测定波长490nm处各孔OD值。记录结果并计算各实验药物抑制病毒的百分率即药物的抗病毒活性(抑制率)。
  
  病毒抑制率(%)=(实验组平均OD值-病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值)×100%-(正常对照血清组OD值-病毒对照组平均OD值)/(细胞对照组平均OD值-病毒对照组平均OD值)×100%,结果见表13,图2。
  
  表13 MTT法研究薄荷-荆芥不同组分配伍组合含药血清对甲型流感病毒增值的抑制作用
  
  实验结果显示:细胞在加入病毒感染后细胞活性降低,病毒组的细胞OD值与正常细胞比较具有显著性差异(P<0.01)。正常对照组含药血清细胞活性比病毒组细胞略有升高,但是与病毒组比较无显著性差异。各组含药血清均对病毒的增殖具有抑制作用,其中阳性药血清、二号药血清、三号药血清、五号药血清、六号药血清、七号药血清对病毒增殖的抑制作用明显,OD值与病毒组比较具有显著性差异(P <0.1,P <0.5)。
  
  3 讨论
  
  流感病毒作为一种常见的呼吸道病毒,病毒株变异快,流行性强。由于病毒只能在宿主细胞内增殖,因而要求药物既要能进入宿主细胞选择性抑制病毒增殖,又要不损害宿主细胞,而目前西药治疗有一定的不良反应,因而急需开发不良反应小而又疗效确切的抗病毒药物[9]。近年来,随着我国传统医学的发展,中医药相关技术的提高,加之我国中药药源丰富,开发抗病毒中药及其制剂具有巨大的开发潜能[10,11]。
  
  中药配伍是中医临床治疗疾病遣方用药的主要形式, 它不仅以其极为丰富多彩的、经过反复验证的有效组方成为辨证论治中不可缺少的主要工具, 而且其理论知识至今有效地指导着临床实践[12]。配伍是中药临床用药的特色,而药对是临床配伍的最小配伍单位[13]。药对是指中医临床上常配伍使用的相对固定的两味药,可相互促进增强药效,或者相互制约、调节以减轻毒副作用[14]。研究药对配伍规律可作为研究复方配伍规律的重要切入点之一,为复方的配伍机制研究提供线索和依据[15]。药对是单味中药与若干方剂之间的桥梁, 是许多方剂隐含的规律性特征与辨证施治内涵的体现[16,17]。研究药对的配伍特点和临床应用规律, 对于解析方剂的组成结构, 掌握遣药组方规律, 提高临床治疗水平, 发展中医药配伍理论和创制现代中药都具有十分重要的理论意义与实践价值[18]。
  
  以薄荷-荆芥经典药对为基础的各种方剂广泛用于临床实践,其中大多数具有抗炎镇痛、抗病毒等作用,两药相须配伍应用的汤剂及成方制剂多达100余种,且疗效确切。本研究通过含药血清对MDCK细胞毒性的测定,计算含药血清的最大无毒剂量;运用CPE法测定甲型流感病毒TCID50,采用Reed-Muench氏法计算甲型流感病毒的TCID50为10-3.5,对流感病毒感染性进行测定;再通过MTT法观察薄荷-荆芥不同组分配伍组合含药血清对甲型流感病毒增值的抑制作用,结果发现各组含药血清均对甲型流感病毒的增殖具有抑制作用,以二号药(薄荷挥发油-薄荷黄酮-荆芥黄酮组合)、三号药(荆芥挥发油-薄荷黄酮-荆芥黄酮组合)、五号药(薄荷挥发油-荆芥挥发油-荆芥黄酮组合)对病毒增殖的抑制作用最为明显。经本课题组前期实验证明,薄荷、荆芥其单味药或单类成分发挥药效并没有两味药配伍后作用明显[19],这正与《神农本草经》中记载的药对配伍有关理论相一致。如“药对配伍有相须者,有相使者,有相畏者,有相恶者,有相反者,有相杀者。”相须相使即为协同作用,相畏相恶相杀即为拮抗作用。协同增效是药对相互作用的主要方面,也是中药配伍的主要目的之一[20]。协同作用的药对为相辅相成药对;薄荷-荆芥药对属气与血对立特性配合的两味药, 合用则一气一血,增强轻能祛实之效,不论风寒、风热的清浅表症,均可适用,协同增效。
  
  本实验研究结果显示薄荷-荆芥不同配伍组分含药血清体外可以抑制流感病毒在细胞内增殖,由此可证实薄荷-荆芥作为核心药对,其不同组分配伍具有确切的抗流感病毒作用,且协同增效,相辅相成。
  
  图1:甲型流感病毒毒力
  
  图2:薄荷-荆芥不同组分配伍组合抗甲型流感病毒的作用
  
  参考文献
  
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