摘 要：目的 探讨疱疹性咽峡炎患儿血清微小RNA-21(miR-21)表达，并分析其与辅助性T淋巴细胞17(Th17)/调节性T淋巴细胞（Treg）、转化生长因子-β1(TGF-β1)、白细胞介素（IL）-17、IL-6、IL-2和IL-10的关系。方法 选取2018年11月至2020年4月在该院就诊的68例疱疹性咽峡炎患儿作为试验组；选取同期在该院体检的63例健康儿童作为对照组。采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测血清中miR-21的表达情况；采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血清中TGF-β1、IL-17、IL-2、IL-6和IL-10水平；采用流式细胞仪检测外周血单个核细胞中的Th17、Treg表达情况，计算Th17/Treg；采用Pearson相关分析miR-21与Th17/Treg及相关炎症因子的相关性。结果 试验组miR-21的相对表达水平、Th17百分率、Th17/Treg高于对照组，Treg百分率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；试验组TGF-β1、IL-17和IL-6水平高于对照组，IL-2和IL-10水平低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；疱疹性咽峡炎患儿血清中miR-21相对表达水平与Th17/Treg、TGF-β1、IL-17及IL-6水平均呈正相关（P<0.05），与IL-2、IL-10水平均呈负相关（P<0.05）。结论 miR-21相对表达水平及Th17/Treg在疱疹性咽峡炎患儿血清中均升高，且二者呈正相关，提示miR-21可能通过影响炎性反应，从而影响疱疹性咽峡炎的疾病进展。
关键词：疱疹性咽峡炎 微小RNA-21 辅助性T淋巴细胞17/调节性T淋巴细胞
Expression and clinical significance of serum miR-21 in children with herpetic angina
DONG Deming ZHAI Min LIAO Tingyan
Department of Pediatrics,Zaoyang First People′s Hospital;
Abstract：Objective To investigate the expression of serum microRNA-21(miR-21)in children with herpetic angina,and to analyze its relationship with helper T lymphocyte 17(Th17)/regulatory T lymphocyte(Treg),transforming growth factor-β1(TGF-β1),interleukin(IL)-17,IL-6,IL-2 and IL-10.Methods A total of 68 children with herpetic angina who were treated in this hospital from November 2018 to April 2020 were selected as the experimental group;63 healthy children who received physical examination in the hospital during the same period were selected as the control group.Real time fluorescent quantitative PCR(qPCR)was used to detect the expression of miR-21 in serum;double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect the levels of TGF-β1,IL-17,IL-2,IL-6 and IL-10 in serum;flow cytometry was used to detect the expression situation of Th17 and Treg in peripheral blood mononuclear cell,and the ratio of Th17/Treg was calculated;Pearson correlation was used to analyze the correlation between miR-21 and Th17/Treg and related inflammatory factors.Results The relative expression level of miR-21,Th17 percentage,and Th17/Treg of the experimental group were higher than those of the control group,and the Treg percentage was lower than that of the control group,the differences were statistically significant(P<0.05);the levels of TGF-β1,IL-17 and IL-6 in the experimental group were higher than those in the control group,while the levels of IL-2 and IL-10 in the experimental group were lower than those in the control group,the differences were statistically significant(P<0.05);the relative expression level of miR-21 in the serum of children with herpangina were positively correlated with Th17/Treg,TGF-β1,IL-17 and IL-6(P<0.05),and negatively correlated with IL-2 and IL-10(P<0.05).Conclusion The relative expression level of miR-21 and Th17/Treg in the serum of children with herpangina are increased,and they are positively correlated,suggesting that miR-21 may affect the disease progression of herpangina by affecting inflammatory response.
Keyword：herpangina; microRNA-21; helper T lymphocyte 17/regulatory T lymphocyte;
疱疹性咽峡炎常发生在幼儿时期，是一种急性上呼吸道感染性疾病，主要由肠道病毒感染所致，具有传染性[1]。该病多发于夏秋季，临床症状有高热、咽痛、流涎、厌食等，患儿咽峡部及软腭可见疱疹，并伴有多发性口腔溃疡[2]。疱疹性咽峡炎常见于1～7岁儿童，可引发心肌炎、脑炎，严重威胁儿童的健康。肠道病毒感染可改变机体体液免疫，致使T淋巴细胞的数量和功能发生改变[3]。微小RNA(miRNA）能在机体炎症相关通路中发挥作用，调节炎性反应。miR-21参与多种肿瘤和自身免疫疾病的发生、发展[4]。研究表明，miR-21过表达可抑制肿瘤坏死因子-α、白细胞介素（IL)-1β和IL-6的表达，并上调IL-10水平，抑制炎性反应[5]。miR-21在疱疹性咽峡炎中的表达及对炎性反应的影响报道较少。辅助性T淋巴细胞（Th)17和调节性T淋巴细胞（Treg）是一对具有拮抗作用的T淋巴细胞亚群，参与维持机体免疫平衡，二者比例失衡与多种炎症性疾病和自身免疫疾病的发病有关[6]。Th17/Treg平衡在疾病中所起的作用已被大量报道，但在疱疹性咽峡炎中的作用少有报道。本研究检测了疱疹性咽峡炎患儿血清中miR-21水平及Th17/Treg平衡的变化，旨在探讨二者的关系及在疱疹性咽峡炎进展过程中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2018年11月至2020年4月在本院就诊的68例疱疹性咽峡炎患儿作为试验组；选取同期在本院体检的63例健康儿童作为对照组。试验组年龄1～6岁，平均（3.59±1.18）岁；男36例，女32例；平均体质量指数（20.16±1.39)kg/m2；散居27例，幼托41例；平均心率（109.37±12.86）次/分；平均舒张压（61.48±10.21)mm Hg，平均收缩压（99.35±11.18)mm Hg。对照组年龄1～6岁，平均（3.82±1.36）岁；男32例，女31例；平均体质量指数（20.35±1.42)kg/m2；散居28例，幼托35例；平均心率（105.43±12.57）次/分；平均舒张压（63.15±9.62)mm Hg，平均收缩压（101.54±11.74)mm Hg。2组受试儿童年龄、性别、体质量指数、是否幼托、心率、舒张压和收缩压比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。本研究经本院伦理委员会批准，所有受试儿童家属均签署知情同意书。
纳入标准：（1）符合《诸福棠实用儿科学》疱疹性咽峡炎诊断标准[7];(2）发病3d内就诊；（3）就诊前两周未使用激素或免疫调节剂；（4)7岁以下儿童。排除标准：（1）先天性心脏病者；（2）合并肝脏、肾脏、肺部疾病者；（3）先天性免疫缺陷者。
1.2 仪器与试剂
Trizol试剂（批号VB459280）购自上海一基实业有限公司；反转录试剂盒（批号KL266）购自上海康朗生物技术有限公司；实时荧光定量PCR(qPCR）试剂盒（批号KK4662）购自美国Kapa Biosystems公司；人转化生长因子-β1(TGF-β1）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒（批号EK0513）购自美国Sciencell公司；IL-17ELISA试剂盒（批号AE0176M/S）、IL-2ELISA试剂盒（批号AE0054M/S）、IL-6ELISA试剂盒（批号AE0048M/S）和IL-10 ELISA试剂盒（批号AE0064M/S）均购自南京善本生物科技有限公司；qPCR仪（型号100133）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；流式细胞仪（型号Gallios）购自美国贝克曼库尔特有限公司。
1.3 方法
1.3.1 样品采集
抽取2组受试儿童的空腹外周静脉血8 mL，其中3 mL外周血加入乙二胺四乙酸抗凝，用于制备外周血单个核细胞（PBMC）；另外5 mL以4 000r/min离心5 min，吸取上层血清，-20℃保存。
1.3.2 qPCR测定血清中miR-21相对表达水平
于-20℃冰箱中取出血清标本，按Trizol试剂说明书提取总RNA；按反转录试剂盒说明书制备cDNA。qPCR反应体系（20μL):2×SYBR Green PCR Master Mix 10μL,cDNA模板2μL，上下游引物各1μL,H2O 6μL，每个标本设置3个复孔。根据目的基因设计相应引物，以U6为内参，序列见表1。反应条件：95℃30s;95℃10s、60℃30s,40个循环。根据各标本平均循环阈值（Ct）值，采用2-ΔΔCt法计算miR-21相对表达水平。
表1 miR-21及内参基因U6引物序列
1.3.3 Th17、Treg的检测
将采集的抗凝外周血采用密度梯度离心法提取PBMC，所得PBMC重悬至1×106个/mL，向重悬好的细胞中加入离子霉素1μg/mL、佛波酯50ng/mL，在含高尔基蛋白转换抑制剂的1640培养基中培养5h。250×g离心5min，将细胞进行固定、染色、透明化处理，其中Th17采用IL-17染色（IL-17阳性细胞为Th17),Treg细胞采用Foxp3染色（Foxp3阳性细胞为Treg）。染色后，采用流式细胞仪检测Th17、Treg表达，计算Th17、Treg百分率及Th17/Treg。
1.3.4 血清中相关炎症因子检测
采用双抗体夹心ELISA法检测血清中TGF-β1、IL-17、IL-2、IL-6和IL-10水平，严格按照ELISA试剂盒说明书操作。
1.4 统计学处理
采用统计学软件SPSS23.0对数据进行处理分析，符合正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验；采用Pearson相关分析miR-21与Th17/Treg及相关炎症因子的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 2组miR-21相对表达水平比较
试验组miR-21的相对表达水平（0.95±0.36）高于对照组（0.49±0.13），差异有统计学意义（t=9.578,P<0.05）。
2.2 2组Th17百分率、Treg百分率、Th17/Treg比较
试验组Th17百分率高于对照组，Treg百分率低于对照组，Th17/Treg高于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。
表2 2组Th17百分率、Treg百分率、Th17/Treg比较（s)
2.3 2组血清中相关炎症因子水平比较
试验组TGF-β1、IL-17和IL-6水平均高于对照组，IL-2和IL-10水平均低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。
表3 2组血清中相关炎症因子水平比较（±s,ng/L)
2.4 血清中miR-21相对表达水平与疱疹性咽峡炎患儿Th17/Treg及炎症因子的相关性
疱疹性咽峡炎患儿血清中miR-21相对表达水平与Th17/Treg、TGF-β1、IL-17及IL-6水平均呈正相关（P<0.05），与IL-2及IL-10水平均呈负相关（P<0.05）。见表4。
表4 疱疹性咽峡炎患儿血清中miR-21相对表达水平与Th17/Treg及炎症因子的相关性
3 讨论
疱疹性咽峡炎大多由柯萨奇A型病毒和肠道病毒71型感染所致，偶发于青少年和成人，多发于儿童，同一个患儿可被多次感染，常伴有吞咽困难、发烧、咳嗽、腹痛、呕吐等症状[8]。该病经呼吸道及粪口途径传播，也能通过手、衣、物等传播。病程一般为4～6d，临床治疗常采用对症治疗为主、口腔局部抗病毒药物治疗为辅的方式，预后良好[9]。少数患儿会出现肺水肿、脑炎、无菌性脑膜炎、心肌炎等并发症，严重者可导致患儿死亡[10]。肠道病毒感染往往会引发机体炎性反应，导致多种炎症因子表达异常。
miRNA是长度为18～25个核苷酸的非编码小RNA，能够与靶基因mRNA 3′非翻译区结合，在转录后调控基因表达的过程中发挥重要作用[11]。miRNA参与人体多种生理活动，部分miRNA可参与调节炎性反应。miR-21在多种肿瘤中呈高表达，发挥致癌作用。研究发现，miR-21在结肠癌中相对表达水平升高，且与IL-6水平呈正相关，miR-21可能通过调节IL-6等炎症因子调控病程进展中的炎症状态[12]。研究表明，miR-21在强直性脊柱炎患者血清中呈高水平，炎症刺激miR-21相对表达水平升高[13]，与本研究结果相符。本研究发现，miR-21在疱疹性咽峡炎患儿血清中相对表达水平升高，提示miR-21可能参与疱疹性咽峡炎的发生、发展。CD4+T淋巴细胞在不同的微环境中分化为不同的T淋巴细胞亚群：Th1、Th2、Th17及Treg，在免疫应答中发挥不同作用[14]。Th1细胞参与细胞介导的免疫应答，Th2细胞可促进体液免疫，Th17主要发挥促炎作用，而Treg则可抑制炎性反应[15]。Th17/Treg失衡是多种免疫相关疾病发病的关键因素。本研究结果显示，疱疹性咽峡炎患儿血清中Th17百分率升高，Treg百分率降低，Th17/Treg升高，提示Th17、Treg参与疱疹性咽峡炎的炎性反应。
Th17能合成并分泌大量IL-17，已成为主要的致病性T淋巴细胞亚群，能产生多种细胞因子，通过多种效应机制介导炎性反应的发生[16]。Treg可抑制CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞的分化及功能，维持自身免疫耐受，抑制过度炎性反应[17]。Th17与Treg相互关联，TGF-β1诱导Treg分化，在IL-6存在时则促进Th17分化[18]。有报道称，miR-21在固有免疫反应前期相对表达水平升高，可激活相关免疫应答，促进炎性反应，在中后期，miR-21相对表达水平降低，此时可抑制IL-6水平，上调IL-10水平，加快免疫稳态的恢复[19]。既往研究显示，miR-21可能通过Toll样受体途径，从而影响T淋巴细胞的功能和分化，参与机体的免疫应答过程[20]。本研究疱疹性咽峡炎患儿血清中TGF-β1、IL-17和IL-6水平均升高，IL-2和IL-10水平均降低，此外，miR-21相对表达水平与Th17/Treg、TGF-β1、IL-17及IL-6水平均呈正相关，与IL-2及IL-10水平均呈负相关，提示miR-21可能通过影响T淋巴细胞的分化及功能，从而影响IL-6、IL-10、IL-17等炎症因子，参与炎性反应。
综上所述，miR-21相对表达水平及Th17/Treg在疱疹性咽峡炎患儿血清中均升高，且二者呈正相关，提示miR-21可能通过影响患儿的炎性反应，从而影响疱疹性咽峡炎的疾病进展。但本研究样本量少，结果可能有局限性，尚需扩大样本量，对相关机制进行深入探讨。
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