摘 要：研究益母草Leonurus japonicus Houtt.果实茺蔚子中木脂素类化学成分及其肝细胞保护活性和作用机制。采用大孔吸附树脂、硅胶、HW-40F凝胶柱色谱及半制备液相色谱等对茺蔚子正丁醇提取部位进行分离纯化，根据理化性质及波谱数据鉴定化合物结构。本文从茺蔚子正丁醇提取部位分离鉴定了8个木脂素类化合物，分别为(+)-异落叶松脂醇-9'-O-β-D-葡萄糖苷（1）、(-)-异落叶松脂醇-9'-O-β-D-葡萄糖苷（2）、马先蒿木脂素（3）、(-)-异落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷（4）、异落叶松脂素（5）、phyllanglaucin B（6）、(-)-7R,8S-7',8'-二羟基-二氢脱氢松柏醇-9-O-β-D-葡萄糖苷（7）、(+)-7S,8R-7',8'-二羟基-二氢脱氢松柏醇-9-O-β-D-葡萄糖苷（8），化合物1~8均为首次从茺蔚子中分离得到。其次，采用MTT法考察化合物对对乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）诱导的HL-7702肝细胞损伤的保护作用，结果表明化合物1和3可显著提高APAP诱导肝细胞损伤的存活率；进而，采用Hoechst 33342荧光染色法和Western blot法观察活性最好的化合物3对细胞凋亡以及Bcl-2和Bax蛋白表达水平的影响。结果显示，与模型组相比，化合物3可使细胞核致密浓染现象变少，凋亡小体减少，同时明显促进Bcl-2蛋白表达，抑制Bax蛋白表达，并升高Bcl-2/Bax比值，表明化合物3的作用机制与调节Bcl-2和Bax蛋白表达量，抑制细胞凋亡有关。
关键词:茺蔚子;木脂素;肝细胞保护;作用机制;细胞凋亡;
Lignans from Leonuri Fructus and their hepatoprotective effects
LIU Juan-ru PENG Cheng HE Yu-in PENG Fang MENG Chun-wang XIONG Liang
State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Institute of Innovative Medicine
Ingredients of Southwest Specialty Medicinal Materials, Chengdu University of Traditional
Chinese Medicine
Abstract：
To study the chemical constituents from Leonuri Fructus (the fruits of Leonurus japonicus Houtt.) and their hepatocellular protective effects and mechanisms. The chemical compounds were isolated from the n-butanol extract of Leonuri Fructus by macroporous resin, silica gel, HW-40F column chromatography, and semi-preparative HPLC. Their structures were determined by physicochemical properties and spectroscopic data. Finally, eight lignans were isolated and identified as (+)-isolariciresinol-9'-O-β-D-glucopyranoside (1), (-)-isolariciresinol-9'-O-β-D-glucopyranoside (2), densispicoside (3), (-)-isolariciresinol-4-O-β-D-glucopyranoside (4), isolariciresinol (5), phyllanglaucin B (6), (-)-7R,8S-7',8'-dihydroxy-dihydrodehydroconiferyl alcohol-9-O-β-D-glucopyranoside (7), and (+)-7S,8R-7',8'-dihydroxy-dihydrodehydroconiferyl alcohol-9-O-β-D-glucopyranoside (8). Compounds 1-8 were isolated from Leonuri Fructus for the first time. Next, MTT assay was used to detect the protective effects of the isolates on acetaminophen (APAP)-induced hepatocyte injury. The results showed that compounds 1 and 3 significantly improved the survival rate of HL-7702 cells injured by APAP. Furthermore, Hoechst 33342 fluorescence staining and Western blot were carried out to observe cell apoptosis in HL-7702 cells and the expression level of Bcl-2 and Bax of compound 3 which has the best hepatoprotective effects. The results showed that compound 3 reduced the nuclear density of HL-7702 cells and the numbers of apoptotic bodies, significantly promoted the expression of Bcl-2 while inhibited the expression of Bax, and increased the ratio of Bcl-2/Bax expression compared with model group. It indicated that compound 3 played a role in suppressing apoptosis in HL-7702 cells by regulating the expression of Bcl-2 and Bax proteins.
Keyword：
the fruits of Leonurus japonicus; lignans; hepatoprotective effect; mechanism; cell apoptosis;
茺蔚子（Leonuri Fructus）来源于唇形科植物益母草（Leonurus japonicus Houtt.）的干燥成熟果实，功善活血调经、清肝明目[1]，始载于《神农本草经》：“味辛、微温。主明目益精，除水气”，药用历史悠久。益母草和茺蔚子是同一植物不同入药部位的两味中药，传统功效亦有异同，《本草纲目》对两味中药的功能主治有所区分：“益母草行血养血……诚为血家之圣药也。茺蔚子治妇女经脉不调，胎产，一切血气诸病妙也。其根茎花叶，并皆入药，可同用。若治手、足厥阴血分风热，清泻肝热，明目益精，调女人经脉，则单用茺蔚子为良。若治肿毒疮疡，消水行血，妇人胎产诸病，则宜并用为良……”[2]。由此可知，益母草及茺蔚子均有活血化瘀之功，但前者长于活血化瘀，后者长于清肝明目。然而，目前对茺蔚子研究的广度及深度远不及益母草，化学研究发现，益母草中已分离鉴定300余个化学成分，且有较多文献阐释了其在舒张血管、抗血小板聚集、调节子宫平滑肌等方面的药理作用和作用机制[3,4,5]，而茺蔚子中报道的化合物不足70个，主要成分类型为三萜、环肽、黄酮、甾醇、苯丙素、木脂素及生物碱等[6,7]。现代药理研究表明，茺蔚子具有收缩子宫[8]、肝细胞保护[9]、抑制酪氨酸酶和乙酰胆碱酯酶活性[10]、抗癌[11]、抗炎[12]、神经保护[13]等作用，然而，大多药理研究仅停留在提取物的药效层面，单体成分的药效及机制研究较少。课题组在前期研究中发现，茺蔚子中的四氢呋喃木脂素类化合物具有显著的肝细胞保护活性[9]，并通过荧光染色、Western blot等手段探索了可能的作用机制。因此，为进一步研究茺蔚子中具有肝保护作用的活性成分，本研究运用多种色谱手段和波谱技术从茺蔚子正丁醇部位又分离鉴定8个木脂素类化合物，进而通过MTT、Hoechst 33342荧光染色和Western blot技术，表征化合物的肝细胞损伤保护作用及作用机制。
1 材料与方法
1.1 仪器
Burker-AVIIIHD-600型核磁共振波谱仪（德国Bruker公司）；Synapt G2 HDMS型高分辨质谱仪（美国Waters公司）；Agilent 1220型半制备型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Ultimate XB-C18色谱柱（250 mm × 10 mm，5 μm；上海月旭科技股份有限公司）；DMI3000B荧光显微镜（德国Leica公司）；Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Tanon 5200显影仪（上海天能科技有限公司）。D101大孔吸附树脂（安徽三星树脂科技有限公司）；柱层析硅胶（青岛海洋硅胶干燥剂厂）；GF254硅胶制备薄层（烟台江友硅胶开发有限公司）；HW-40F（日本TOSOH公司）。
1.2 药材与试剂
茺蔚子药材于2016年9月购自四川省成都市荷花池药材市场，由成都中医药大学中药鉴定教研室高继海副教授鉴定为益母草Leonurus japonicus Houtt.的干燥成熟果实，标本（SCWZ-0917）现存于成都中医药大学西南特色药材创新药物成分研究所。HL-7702人正常肝细胞（美国博士德生物科技有限公司，批号：CX0157）；Gibco DMEM（美国Thermo Fisher Scientific公司，批号：8121052）；胰蛋白酶（Solarbio公司，批号：9100041）；新生牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：20100201）；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS，pH=7.8）、辣根酶标记山羊抗体IgG（H+L）（北京中杉金桥生物技术有限公司）；蛋白定量测试盒（南京建成生物工程研究所）；Anti-Bcl-2抗体、Anti-Bax抗体（英国Abcam公司）；Anti-β-actin（美国Gene Tex公司）；Hoechst 33342染色液（上海碧云天生物技术有限公司）；Omni-ECLTM超灵敏化学发光检测试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司）。甲醇、乙醇等分析纯试剂均购于成都科龙化工试剂厂；色谱甲醇（美国Sigma公司）；氘代甲醇（CD3OD，美国剑桥CIL（同位素标准品）公司）；对乙酰氨基酚（APAP，成都克洛玛生物科技有限公司，批号：CHB210112）；噻唑蓝（MTT，北京金泰宏达生物科技有限公司，批号：EZ6789A155）。
1.3提取与分离
称取60 kg茺蔚子药材，加入8倍量体积的70%乙醇，回流提取3次，每次2 h。合并提取液，减压浓缩，得乙醇浸膏（3.5 kg）。将浸膏分散于热水中，依次采用乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到茺蔚子乙酸乙酯部位（0.9 kg）和正丁醇部位（1.8 kg）。取正丁醇部位，采用D-101大孔吸附树脂柱进行分离纯化，依次用10%、30%、50%、70%、95%乙醇溶液进行梯度洗脱，回收溶剂后得到5个洗脱部分（F1~F5）。
采用含1% NaOH的硅胶填料对F2进行柱色谱分离，用二氯甲烷-甲醇（50∶1→0∶1）溶液进行梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检测，合并相似流分，回收溶剂得到17个组分（F2-1~F2-17）。F2-14经阳离子交换树脂柱色谱（纯水、80%乙醇、80%氨水乙醇）进行梯度洗脱，取80%氨水乙醇洗脱部位，再采用HW-40F凝胶柱色谱（90%甲醇-水）进行分离，得到4个部分（F2-14-1~F2-14-4）。F2-14-3再经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水（50∶1∶0→3∶2∶0.25）进行梯度洗脱，得到6个部分（F2-14-3A~F2-14-3F）。其中，F2-14-3F经反相半制备液相色谱（28%甲醇-水）分离，得到化合物2（2.6 mg，tR = 75 min）和化合物4（2.8 mg，tR = 68 min）。F2-15通过反相中压液相色谱分离，以甲醇-水（5%→100%）溶液进行梯度洗脱，得到17个部分（F2-15-1~F2-15-17）。F2-15-9经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水（50∶1∶0→3∶2∶0.25）进行梯度洗脱，再经反相半制备液相色谱（38%甲醇-水）分离，得到化合物1（6.0 mg，tR = 62 min）。F2-15-14经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水（50∶1∶0→3∶2∶0.25）进行梯度洗脱，再经反相半制备液相色谱（35%甲醇-水）分离，得到化合物3（2.0 mg，tR = 46 min）。
采用硅胶柱色谱对F3进行分离，用二氯甲烷-甲醇（100∶1→0∶1）进行梯度洗脱，共得到18个洗脱部分（F3-1~F3-18）。取F3-12经反相C18减压色谱柱分离，以甲醇-水（10%→100%）进行梯度洗脱，得到6个部分（F3-12-1~F3-12-6）。其中，F3-12-1经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（50∶1→0∶1）进行梯度洗脱，得到10个部分（F3-12-1A~F3-12-1J）。F3-12-1G经反相半制备液相色谱（42%甲醇-水）制备得到化合物6（0.4 mg，tR = 40 min）。F3-12-1J经反相半制备液相色谱（35%甲醇-水）进行制备，得到化合物5（3.4 mg，tR = 70 min）。取F3-17经反相中压色谱分离，以甲醇-水梯度洗脱（10%→100%），得到12个部分（F3-17-1~F3-17-12）。F3-17-11经硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇溶液（50∶1→0∶1）进行梯度洗脱，再经半制备液相色谱（36%甲醇-水）洗脱，分别得到化合物7（0.9 mg，tR = 17 min）和8（2.0 mg，tR = 33 min）。
1.4 肝细胞保护活性筛选及作用机制研究
1.4.1 肝细胞保护活性筛选
采用MTT法检测化合物1~8对APAP诱导的人正常肝细胞HL-7702损伤的保护作用。HL-7702细胞用含1%青霉素-链霉素和10%灭活新生牛血清的DMEM完全培养基培养。取对数生长期的细胞株悬液，每孔100 μL接种至96孔板（约3×103个细胞/孔），置于37 ℃，5%CO2，95%空气培养箱中培育。待细胞贴壁后，分为空白组、模型组和给药组，每个组设3个复孔。空白组为含1%新生牛血清的DMEM；模型组采用30 mmol/L APAP造模4 h；给药组经30 mmol/L APAP诱导损伤4 h后，分别加入浓度为50、25、12.5、6.25、3.13、1.5 μmol/L的待测化合物。继续孵育24 h后，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，继续孵育4 h后移除上清液，向每孔加入DMSO 180 μL，震荡混匀，酶标仪测定各组在490 nm的吸光度值（OD）。
细胞保护率=(OD给药-OD模型)/(OD空白-OD模型)×100%，并由此得出EC50值（EC50是细胞保护率为50%时的化合物浓度）。
1.4.2 凋亡实验
取对数生长期的HL-7702细胞株悬液，每孔2 mL接种至6孔板（约3×103个细胞/孔），置于培养箱中培养，分组给药，空白组和模型组同“1.4.1”；给药组经30 mmol/L APAP造模4 h后，移去上清液，加入浓度为20、10、5、2 μmol/L的化合物3。继续孵育24 h后弃去上清液，PBS清洗2次，再加入Hoechst 33342染色液（用PBS稀释1000倍）50 μL/孔，避光染色15 min。弃去染色液，PBS清洗3次，于倒置显微镜下观察并拍摄细胞和荧光细胞核图片。
1.4.3 Western blot检测对凋亡关键蛋白表达的影响
取“1.4.2”项下细胞，弃去上清液，用PBS清洗3次，收集细胞，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，用细胞刮刮下各孔内细胞，粉碎细胞2 min，于4 ℃离心机12 000 r/min离心15 min，取少量上清液，用考马斯亮蓝法测定细胞蛋白浓度。剩余上清液经变性处理，用10% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶、5%浓缩胶分离蛋白，转膜，再用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭2 h。一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，TBST洗3次。二抗（1∶5 000）37 ℃孵育1 h，TBST清洗3次，显影拍照，并对蛋白条带进行灰度分析。
2 结果
2.1 结构鉴定
化合物1 白色无定形粉末；[α]20D +62.5（c 0.05，MeOH）；ESI-MS：m/z 545.2 [M + Na ]+；1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.79（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2ʹ），6.74（1H，d，J = 8.4 Hz，H-5ʹ），6.65（1H，s，H-2），6.64（1H，dd，J = 8.4，1.8 Hz，H-6ʹ），6.18（1H，s，H-5），4.12（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1ʹʹ），4.09（1H，d，J = 10.8 Hz，H-7ʹ），4.06（1H，dd，J = 10.2，2.4 Hz，H-9ʹa），3.83（1H，dd，J = 12.0，2.4 Hz，H-6ʹʹa），3.81（s，3-OCH3），3.80（s，3ʹ-OCH3），3.77（1H，dd，J = 10.8，3.6 Hz，H-9a），3.72（1H，dd，J = 10.8，6.0 Hz，H-9b），3.64（1H，dd，J = 12.0，5.4 Hz，H-6ʹʹb），3.34（1H，t，J = 9.0 Hz，H-3ʹʹ），3.27（1H，t，J = 9.0 Hz，H-4ʹʹ），3.23（1H，dd，J = 10.2，3.0 Hz，H-9ʹb），3.21~3.17（2H，m，H-2ʹʹ，5ʹʹ），2.84（1H，dd，J = 16.2，10.2 Hz，H-7a），2.80（1H，dd，J = 16.2，6.0 Hz，H-7b），2.10（1H，m，H-8），1.88（1H，m，H-8ʹ）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：129.1（C-1），112.4（C-2），147.1（C-3），145.8（C-4），117.4（C-5），134.4（C-6），33.9（C-7），39.5（C-8），65.2（C-9），138.7（C-1ʹ），114.3（C-2ʹ），148.9（C-3ʹ），145.1（C-4ʹ），116.1（C-5ʹ），123.1（C-6ʹ），47.9（C-7ʹ），45.9（C-8ʹ），69.4（C-9ʹ），105.2（C-1ʹʹ），75.2（C-2ʹʹ），78.1（C-3ʹʹ），71.7（C-4ʹʹ），77.9（C-5ʹʹ），62.8（C-6ʹʹ），56.4（3-OCH3），56.4（3ʹ-OCH3）。以上数据与文献[14]报道一致，故鉴定化合物为(+)-异落叶松脂醇-9ʹ-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物2 白色无定形粉末；[α]20D -36.6（c 0.13，MeOH）；ESI-MS：m/z 545.2 [M + Na ]+；1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.74（1H，d，J = 9.6 Hz，H-5ʹ），6.69（1H，d，J = 2.4 Hz，H-2ʹ），6.65（1H，s，H-2），6.65（1H，dd，J = 9.6，2.4 Hz，H-6ʹ），6.18（1H，s，H-5），4.05（1H，d，J = 9.6 Hz，H-1ʹʹ），3.84（H，m，H-7ʹ），3.81（3H，s，3-OCH3），3.79（3H，s，3ʹ-OCH3），3.78（1H，overlapped，H-6ʹʹa），3.76~3.66（4H，m，H-9，9ʹ），3.64（1H，m，H-6ʹʹb），3.32（1H，overlapped，H-3ʹʹ），3.27（1H，t，J = 10.8，H-4ʹʹ），3.27（1H，t，J = 10.8，H-5ʹʹ），3.16（1H，t，J = 9.0，H-2ʹʹ），2.89（1H，dd，J = 19.2，12.0 Hz，H-7a），2.75（1H，dd，J = 19.2，3.6 Hz，H-7b），1.97（2H，m，H-8，8ʹ）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：129.2（C-1），112.3（C-2），147.3（C-3），146.0（C-4），117.4（C-5），133.7（C-6），33.6（C-7），41.1（C-8），65.5（C-9），138.8（C-1ʹ），114.0（C-2ʹ），149.0（C-3ʹ），145.3（C-4ʹ），116.0（C-5ʹ），123.5（C-6ʹ），49.0（C-7ʹ），45.3（C-8ʹ），70.8（C-9ʹ），103.8（C-1ʹʹ），75.0（C-2ʹʹ），77.9（C-3ʹʹ），71.5（C-4ʹʹ），78.2（C-5ʹʹ），62.5（C-6ʹʹ），56.4（3-OCH3），56.5（3ʹ-OCH3）。以上数据与文献[15]报道一致，故鉴定化合物为(-)-异落叶松脂醇-9ʹ-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物3 白色无定形粉末；[α]20D -144.0（c 0.17，MeOH）；ESI-MS：m/z 545.2 [M + Na ]+；1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.79（1H，s，H-2ʹ），6.70（1H，s，H-2），6.63（1H，d，J = 7.8 Hz，H-5ʹ），6.41（1H，d，J =7.8 Hz，H-6ʹ），6.34（1H，s，H-5），4.27（H，d，J = 8.4，H-1ʹʹ），4.26（H，d，J = 4.8，H-7ʹ），3.87（1H，d，J = 11.4 Hz，H-6ʹʹa），3.83（3H，s，3-OCH3），3.80（1H，overlapped，H-9ʹa），3.78（3H，s，3ʹ-OCH3），3.66（1H，dd，J = 11.4，5.4 Hz，H-6ʹʹb），3.60（1H，dd，J = 11.4，4.8 Hz，H-9a），3.56（1H，dd，J = 11.4，5.4 Hz，H-9b），3.46（1H，dd，J = 9.6，6.6 Hz，H-9ʹb），3.35~3.20（4H，m，H-2ʹʹ，3ʹʹ，4ʹʹ，5ʹʹ），2.92（1H，dd，J = 16.8，6.0 Hz，H-7a），2.68（1H，dd，J = 16.8，10.8 Hz，H-7b），2.25（1H，m，H-8），2.03（1H，m，H-8ʹ）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：128.5（C-1），112.3（C-2），147.8（C-3），145.8（C-4），117.1（C-5），133.1（C-6），33.2（C-7），35.4（C-8），65.2（C-9），135.8（C-1ʹ），115.7（C-2ʹ），148.1（C-3ʹ），145.5（C-4ʹ），115.4（C-5ʹ），124.2（C-6ʹ），46.6（C-7ʹ），42.1（C-8ʹ），71.6（C-9ʹ），104.5（C-1ʹʹ），75.4（C-2ʹʹ），78.2（C-3ʹʹ），71.9（C-4ʹʹ），78.0（C-5ʹʹ），63.0（C-6ʹʹ），56.5（3-OCH3），56.3（3ʹ-OCH3）。以上数据与文献[16]报道一致，故鉴定化合物为马先蒿木脂素。
化合物4 浅黄色粉末；[α]20D -62.1（c 0.15，MeOH）；ESI-MS：m/z 523.2 [M + H ]+；1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.78（1H，d，J = 9.6 Hz，H-5ʹ），6.77（1H，s，H-2），6.72（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2ʹ），6.65（1H，dd，J = 9.6，1.8 Hz，H-6ʹ），6.52（1H，s，H-5），4.40（1H，d，J = 9.0 Hz，H-1ʹʹ），3.87（1H，d，J = 12.6 Hz，H-7ʹ），3.85（3H，s，3-OCH3），3.82（1H，m，H-6ʹʹa），3.82（3H，s，3ʹ-OCH3），3.72（2H，m，H-9），3.68（2H，m，H-9ʹ），3.64（1H，m，H-6ʹʹb），3.45~3.39（4H，m，H-2ʹʹ，3ʹʹ，4ʹʹ，5ʹʹ），2.84（2H，d，J =7.6 Hz，H-7），2.07（1H，m，H-8），1.81（1H，m，H-8ʹ）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：132.2（C-1），113.2（C-2），148.6（C-3），146.3（C-4），118.9（C-5），134.7（C-6），33.4（C-7）39.9（C-8），62.3（C-9），138.2（C-1ʹ），113.8（C-2ʹ），149.0（C-3ʹ），146.1（C-4ʹ），116.1（C-5ʹ），123.2（C-6ʹ），48.2（C-7ʹ），47.5（C-8ʹ），65.8（C-9ʹ），103.4（C-1ʹʹ），74.6（C-2ʹʹ），77.9（C-3ʹʹ），70.8（C-4ʹʹ），77.8（C-5ʹʹ），61.9（C-6ʹʹ），56.8（3-OCH3），56.4（3ʹ-OCH3）。以上数据与文献[17]报道一致，故鉴定化合物为(-)-异落叶松脂醇-4-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物5 白色无定形粉末；ESI-MS：m/z 383.1 [M + Na ]+；1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.74（1H，d，J = 7.8 Hz，H-5ʹ），6.68（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2ʹ），6.66（1H，s，H-2），6.62（1H，dd，J = 7.8，1.8 Hz，H-6ʹ），6.18（1H，s，H-5），3.81（1H，overlapped，H-7ʹ），3.81（3H，s，3-OCH3），3.78（3H，s，3ʹ-OCH3），3.71（1H，dd，J = 11.4，4.8 Hz，H-9ʹa），3.66（2H，m，H-9），3.40（1H，dd，J = 11.4，4.2 Hz，H-9ʹb），2.78（2H，d，J = 7.8 Hz，H-7），2.00（1H，m，H-8），1.76（1H，m，H-8ʹ）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：129.0（C-1），112.4（C-2），147.2（C-3），145.9（C-4），117.3（C-5），134.2（C-6），33.6（C-7），40.0（C-8），66.0（C-9），138.6（C-1ʹ），113.8（C-2ʹ），149.0（C-3ʹ），145.2（C-4ʹ），116.0（C-5ʹ），123.2（C-6ʹ），48.1（C-7ʹ），48.0（C-8ʹ），62.2（C-9ʹ），56.4（3-OCH3），56.3（3ʹ-OCH3）。以上数据与文献[18]报道一致，故鉴定化合物为异落叶松脂素。
化合物6 白色无定形粉末；ESI-MS：m/z 561.2 [M + Na ]+；1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.68（1H，s，H-2ʹʹ），6.62（1H，s，H-5ʹʹ），6.62（1H，d，J = 1.8 Hz，H-6ʹ），6.59（1H，d，J = 8.4 Hz，H-5），6.57（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2），6.42（1H，dd，J = 8.4，1.8 Hz，H-6），6.37（1H，d，J = 1.8 Hz，H-2ʹ），5.46（1H，d，J = 1.8 Hz，H-7），4.04（1H，d，J = 9.0 Hz，H-7ʹ），3.86（3H，s，3ʹʹ-OCH3），3.83（1H，dd，J = 10.8，4.2 Hz，H-9a），3.72（3H，s，3-OCH3），3.70（1H，dd，J = 11.4，3.6 Hz，H-9ʹa），3.66（2H，m，H-9ʹʹ），3.51（1H，dd，J = 11.4，3.6 Hz，H-9ʹb），3.46（1H，dd，J = 10.8，9.0 Hz，H-9b），3.46（3H，s，3ʹ-OCH3），2.80（1H，dd，J = 15.6，4.8 Hz，H-7ʹʹa），2.74（1H，dd，J = 15.6，12.0 Hz，H-7ʹʹb），2.66（1H，m，H-8），1.89（1H，m，H-8ʹʹ），1.71（1H，m，H-8ʹ）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：134.9（C-1），110.2（C-2），148.8（C-3），146.9（C-4），115.7（C-5），118.9（C-6），87.5（C-7），54.2（C-8），63.3（C-9），138.1（C-1ʹ），112.7（C-2ʹ），149.1（C-3ʹ），147.9（C-4ʹ），128.3（C-5ʹ），122.9（C-6ʹ），45.5（C-7ʹ），49.6（C-8ʹ），61.4（C-9ʹ），131.8（C-1ʹʹ），113.6（C-2ʹʹ），145.0（C-3ʹʹ），145.8（C-4ʹʹ），115.6（C-5ʹʹ），130.5（C-6ʹʹ），34.4（C-7ʹʹ），39.6（C-8ʹʹ），65.8（C-9ʹʹ），56.3（3-OCH3），56.0（3ʹ-OCH3），56.6（3ʹʹ-OCH3）。以上数据与文献[19]报道一致，故鉴定化合物为phyllanglaucin B。
化合物7 白色无定形粉末；ESI-MS：m/z 577.2 [M + Na ]+；1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：6.99（1H，s，H-6ʹ），6.96（1H，s，H-2），6.95（1H，s，H-2ʹ），6.87（1H，d，J = 8.4 Hz，H-6），6.76（1H，d，J = 8.4 Hz，H-5），5.63（1H，d，J = 6.0 Hz，H-7），4.57（1H，d，J = 6.0 Hz，H-7ʹ），4.35（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1ʹʹ），4.22（1H，dd，J = 9.6，5.4 Hz，H-9a），3.89（3H，s，3-OCH3），3.86（1H，m，H-8ʹ），3.83（3H，s，3ʹ-OCH3），3.67（2H，m，H-8，9b），3.52（1H，dd，J = 11.4，4.2 Hz，H-9ʹa），3.39（1H，dd，J = 11.4，6.6 Hz，H-9ʹb）；13C NMR（150 MHz，CD3OD），δ：134.6（C-1），110.7（C-2），149.0（C-3），148.8（C-4），116.9（C-5），119.7（C-6），89.1（C-7），53.2（C-8），72.3（C-9），129.6（C-1ʹ），112.7（C-2ʹ），145.3（C-3ʹ），147.5（C-4ʹ），137.0（C-5ʹ），116.1（C-6ʹ），75.2（C-7ʹ），77.6（C-8ʹ），62.3（C-9ʹ），104.6（C-1ʹʹ），75.5（C-2ʹʹ），78.2（C-3ʹʹ），71.6（C-4ʹʹ），78.1（C-5ʹʹ），62.8（C-6ʹʹ），56.4（3-OCH3），56.7（3ʹ-OCH3）。以上数据与文献[20]报道一致，故鉴定化合物为(-)-7R,8S-7ʹ,8ʹ-二羟基-二氢脱氢松柏醇-9-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物8 白色无定形粉末；ESI-MS：m/z 577.2 [M + Na ]+；1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.00（1H，s，H-6ʹ），6.98（1H，s，H-2），6.95（1H，s，H-2ʹ），6.85（1H，d，J = 8.4 Hz，H-6），6.76（1H，d，J = 8.4 Hz，H-5），5.62（1H，d，J = 6.6 Hz，H-7），4.57（1H，d，J = 6.6 Hz，H-7ʹ），4.35（1H，d，J = 7.8 Hz，H-1ʹʹ），4.13（1H，t，J = 9.0 Hz，H-9a），3.86（1H，m，H-8ʹ），3.87（3H，s，3-OCH3），3.83（3H，s，3ʹ-OCH3），3.68（2H，m，H-8，9b），3.51（1H，dd，J = 11.4，4.2 Hz，H-9ʹa），3.39（1H，dd，J = 11.4，6.0 Hz，H-9ʹb）；13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：134.5（C-1），110.8（C-2），149.0（C-3），148.8（C-4），117.0（C-5），119.7（C-6），89.3（C-7），52.9（C-8），72.3（C-9），129.6（C-1ʹ），112.6（C-2ʹ），145.3（C-3ʹ），147.5（C-4ʹ），137.0（C-5ʹ），116.1（C-6ʹ），75.2（C-7ʹ），77.6（C-8ʹ），64.3（C-9ʹ），104.2（C-1ʹʹ），75.4（C-2ʹʹ），78.2（C-3ʹʹ），71.6（C-4ʹʹ），78.1（C-5ʹʹ），62.8（C-6ʹʹ），56.5（3-OCH3），56.7（3ʹ-OCH3）。以上数据与文献[20]报道一致，故鉴定化合物为(+)-7S,8R-7ʹ,8ʹ-二羟基-二氢脱氢松柏醇-9-O-β-D-葡萄糖苷。
化合物1~8的化学结构见图1。
2.2 肝细胞保护活性筛选及作用机制研究
2.2.1 肝细胞保护活性筛选
采用MTT法筛选化合物1~8的肝细胞保护活性，模型组用APAP诱导HL-7702肝细胞损伤。与空白对照组相比，模型组细胞存活率明显下降（P<0.01）。化合物1和3可显著增加APAP诱导受损肝细胞HL-7702的存活率，EC50分别是10.23 ± 2.45 μmol/L和5.20 ± 1.28 μmol/L。
2.2.2 Hoechst 33342荧光染色检测化合物3抑制HL-7702细胞凋亡的作用
取活性显著的化合物3，观察其抑制HL-7702细胞凋亡的作用。Hoechst 33342荧光染色结果显示，空白组细胞呈现微弱荧光；模型组细胞呈亮蓝色荧光，细胞核皱缩、呈现致密浓染现象；2~20 μmol/L化合物3给药后，细胞荧光强度减弱，且随着给药浓度增加，凋亡小体逐渐减少，细胞逐渐恢复正常形态，结果见图2。
2.2.3 Western blot检测化合物3对Bcl-2和Bax蛋白的表达水平
取活性显著的化合物3，利用Western blot技术检测其对APAP诱导损伤的HL-7702细胞内Bcl-2和Bax蛋白表达的影响。由图3可知，与空白组相比，模型组Bcl-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加，Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.01）。与模型组相比，5~20 μmol/L的化合物3均可上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，显著升高Bcl-2/Bax比值，且具有一定的剂量依赖性。
3 讨论与结论
本研究从茺蔚子的正丁醇部位分离鉴定了8个木脂素类化合物，且化合物1~8均为首次从茺蔚子中分离得到。目前从茺蔚子中分离得到的化合物以三萜为主，而课题组研究至今，已从茺蔚子中分离得到23个木脂素类成分[7,9]。文献研究发现[3,6]，从益母草和茺蔚子中分离得到的单体化合物均以萜类成分为主，但益母草中鲜少报道木脂素类成分，因而推测木脂素类成分是茺蔚子与益母草的差异性物质基础。
对乙酰氨基酚也称扑热息痛，为苯胺类解热镇痛药，过量服用易引起肝损伤甚至肝衰竭，主要通过引起肝细胞内线粒体功能障碍和细胞凋亡造成严重的肝毒性[21]。因此，APAP常被用作药物性肝损伤的造模药[22,23,24]。本实验采用APAP建立体外肝损伤模型，对分离得到的化合物进行肝细胞保护活性筛选，结果化合物1和3可显著抑制APAP诱导的肝细胞损伤，EC50分别是10.23 ± 2.45 μmol/L和5.20 ± 1.28 μmol/L。同时，利用荧光染色实验观察到化合物3可抑制HL-7702细胞凋亡。
细胞凋亡的内在途径受B细胞淋巴瘤（Bcl-2）家族蛋白调节，Bcl-2家族蛋白形成蛋白质-蛋白质相互作用网络，通过影响线粒体外膜的通透性来调节细胞凋亡，其中Bcl-2和Bax是一对调控细胞凋亡的关键蛋白，Bcl-2为抗凋亡蛋白，可增强肝细胞对大多数DNA损伤因子的抵抗性，Bax为促凋亡蛋白，可诱导线粒体膜通透性增强并释放细胞色素c，引起细胞凋亡[23,25,26,27]，而Bcl-2与Bax蛋白表达量的比值反映出细胞受凋亡刺激后的生存能力[28]。为进一步探讨化合物3抑制细胞凋亡的机制，本研究采用Western blot技术检测其对Bcl-2和Bax蛋白的表达水平，结果表明化合物3可上调Bcl-2蛋白表达，下调Bax蛋白表达，并升高Bcl-2/Bax比值，提示化合物3可能通过调节Bcl-2和Bax蛋白表达量发挥抗凋亡作用，从而起到肝细胞保护效果。
本研究对茺蔚子中具有肝细胞保护活性的药效物质基础及作用机制进行了探索，为阐明茺蔚子的传统功效提供依据，有利于后续对药材资源的合理开发和利用。迄今为止，课题组已从茺蔚子中分离得到6个具有肝细胞保护活性的木脂素类成分，包括fruleoligide A、fruleoligide B、lariciresinol-4-O-β-D-glucoside、lariciresinol-4ʹ-O-β-D-glucoside、(+)-异落叶松脂醇-9ʹ-O-β-D-葡萄糖苷、马先蒿木脂素[9]。《本草纲目》认为茺蔚子善于清肝明目，但目前对于其清肝明目的物质基础和作用机制的研究较少，通过课题组的研究可以发现茺蔚子的木脂素类成分具有较好的肝细胞保护作用，可能是茺蔚子清肝明目的活性物质基础。
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