摘 要：目的：考察盐酸吉西他滨（gemcitabine hydrochloride，GEM）溶于0.9%氯化钠（normal saline，NS）或NS和人工尿液(artificial urine，AU)的混合溶液中，在不同浓度和温度下的稳定性，为GEM用于膀胱热灌注化疗提供热稳定性依据。方法：分别配置GEM 2 g和3 g，溶于NS或NS混合AU为溶媒的样品（简写为GEM 2 g+NS，GEM 2 g+ NS + AU 、GEM 3 g+ NS，GEM 3 g+NS+AU），检测在室温（25 ℃）恒温6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h内热稳定性的变化。根据2020年版《中国药典》中的方法测定样品的PH、溶液性状和澄清度、可见异物、有关物质和GEM含量的变化。结果：GEM 2 g+NS，GEM 2 g+ NS+ AU 、GEM 3 g+ NS ，GEM 3 g+NS +AU 在室温（25 ℃）恒温 6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h后，均为无色澄清溶液，pH维持在3.6，有关物质中胞嘧啶最大值为（0.000 7±0.000 08）%，α-异构体未检出，最大未知单杂最大值为（0.03±0.009）%，总杂最大值为（0.04±0.03）%，GEM含量在（98.85±0.75）%~（100.65±1.16）%之间（RSD≤ 1%）。结论：GEM在NS或NS混合AU为溶媒中，分别在室温（25 ℃）恒温6 h，37 ℃，43 ℃，45 ℃，47 ℃，50 ℃恒温2 h，稳定性良好，可用于膀胱热灌注化疗。
关键词:膀胱癌;盐酸吉西他滨;膀胱热灌注化疗;热稳定性;
Thermal stability study of gemcitabine hydrochloride used in hyperthermic intravesical
chemotherapy
ZHANG Mei-mei LI Jing PANG Ting-yuan LI Jia
LIU Xiao-rui LIN Wei FANG Shu-xian
ZENG Li-si JIAN Xiao-shun
Department of Pharmacy, filiated Cancer Hospital & Institute of Guangzhou Medical University
Department of Urology, filiated Cancer Hospital & Institute of Guangzhou Medical University
Department of Gastrointestinal Surgery 2 Section, filiated Cancer Hospital & Institute of
Guangzhou Medical University
Institute of Oncology, fliated Cancer Hospital & Institute of
Guangzhou Medical University
Abstract：
OBJECTIVE To investigate the stability of Gemcitabine Hydrochloride (GEM) dissolved in 0.9% normal saline solution (NS) and NS mixed Artificial urine (AU) solution, at different concentrations and temperatures, so as to provide the oretical basis for GEM applied in hyperthermia intravesical chemotherapy. METHODS We prepared the solution of test sample(short for GEM 2 g+ NS, GEM 2 g+ NS+ AU, GEM 3 g+ NS，GEM 3 g+NS +AU), separately. The temperatures were kept in room temperature (25 ℃) for 6 h, and 37, 43, 45, 47, 50 ℃for 2 h. The pH value, clarity test, visible particles, the related substances and contents of GEM were determined according to The Chinese Pharmacopoeia (version 2020). RESULTS The solution of GEM 2 g+NS，GEM 2 g+ NS+ AU、GEM 3 g+ NS，GEM 3 g+NS +AU were all clear, colorless and transparent, the pH value was 3.6. The contents of GEM remained stable at 25 ℃ for 6 h, and 37, 43, 45, 47, 50 ℃for 2 h, respectively. The related substances and contents of GEM were also stable, which the maximum value of cytosine was (0.000 7±0.000 08)% ,α-isomer can’t detected, the unknown single heterogeneous were less than (0.03±0.009)%, the total miscellaneous was less than (0.04±0.03)%, while the contents of GEM were between (98.85±0.75)% and (100.65±1.16)%（RSD≤ 1%）. CONCLUSION GEM has good thermal stability in different concentrations, remained stable at 25 ℃ for 6 h, and 37 ℃, 43 ℃, 45 ℃, 47 ℃, 50 ℃ for 2 h, including in NS and AU, and can be an ideal selection used in hyperthermic intravesical chemotherapy of bladder cancer.
Keyword：
bladder cancer; gemcitabine; hyperthermic intravesical chemotherapy; thermal stability;
经尿道膀胱肿瘤切除术（transurethral resection of bladder tumor，TURBT）是非肌层浸润性膀胱癌诊断和治疗的主要手段，但单用TURBT的患者肿瘤复发率高[1]，TURBT术后向膀胱内注入细胞毒性药物或者免疫制剂，能够降低肿瘤复发和进展的风险[2]。膀胱热灌注化疗（hyperthermic intra vesical chemotherapy，HIVEC）是将化疗药物灌流液加热至45±2 ℃，并保持该温度在膀胱内循环灌注60 min[3] ，利用热能对肿瘤细胞的杀伤作用以及热能与化疗药物的协同作用，增强肿瘤细胞对药物的敏感性和通透性，有效地杀灭和清除腔内残留的癌细胞和表面转移灶[4]。因此，膀胱灌注化疗药物的热稳定性是选择热灌注化疗的重要依据。吉西他滨具有广泛的抗癌活性，研究证明其对膀胱的局部刺激少，全身不良反应低 [5]。但吉西他滨作为HIVEC灌流液，在长时间加热和生理尿液的影响下，其药物的稳定性变化，目前未见相关报道。本研究根据2020年版《中国药典》中的方法，考察盐酸吉西他滨在HIVEC系统中，其溶液体系稳定性的变化，为临床应用提供理论依据。
1. 材料与仪器
1.1 仪器
XS205DU电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），ML802T/02电子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），S220酸度计（瑞士METTLER TOLEDO公司），Ultimate 3000高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司），DKZ-1恒温振荡水槽（上海一恒科技有限公司），YB-2澄明度检测仪（天津天大天发科技有限公司）。
1.2 试药
盐酸吉西他滨对照品（批号100622-201903，含量：99.9%，中国食品药品检定研究院）；胞嘧啶对照品（批号420017-201702，含量99.8%，中国食品药品检定研究院）；注射用盐酸吉西他滨（批号621210701，621210702，621210801，规格：1.0 g，江苏豪森药业集团有限公司）；人工尿液（批号1009A21，信帆生物）；甲醇（色谱纯，Merck）；纯化水自制。
2. 方法与结果
2.1 溶液制备
按照临床膀胱热灌注用法用量，取3个不同批号的注射用盐酸吉西他滨，均按照供试品溶液1，2，3，4处理，每个样本取3次检测，结果取3个批号9次检测结果的平均值。
2.1.1 供试品1（Gem 2 g+NS）
Gem 2 g 溶解于NS 150 mL的比例，取注射用盐酸吉西他滨20瓶，用NS 1 500 mL溶解，得13.33 mg·mL-1GEM。取250 mL置于25 ℃，分别于0，1，2，4，6 h取样；另取200 mL分别置于37，43，45，47，50 ℃恒温水槽中，振荡，分别于0，0.5，1，1.5，2 h取样。用于溶液酸度，澄清度和颜色检查及可见异物检查（n=3）。精密量取样品溶液3 mL置于20 mL量瓶，用纯化水稀释定容，作为有关物质供试品溶液；精密量取样品溶液1 mL置于100 mL量瓶，用纯化水稀释定容，作为含量供试品溶液。
2.1.2 供试品2（Gem 2 g+NS+AU）
Gem 2 g 溶解于NS 150mL，同时膀胱热灌注过程中1 h约产生150 mL尿液。取注射用盐酸吉西他滨12瓶，用NS 900 mL和人工尿液900 mL溶解，得6.67 mg·mL-1GEM。溶液酸度和澄清度和颜色检查方法同“2.1.1”项。由于人工尿液中本身含有可见异物，样本不检查可见异物。分别精密量取样品溶液3 mL置于10，200 mL量瓶，用纯化水稀释定容，作为有关物质及含量供试品溶液。
2.1.3 供试品3（Gem 3 g+NS）
Gem 3 g 溶解于NS 150 mL，取注射用盐酸吉西他滨30瓶，用NS 1 500 mL溶解，得20 mg·mL-1GEM 。溶液酸度，澄清度和颜色检查及可见异物检查方法同“2.1.1”项。分别精密量取样品溶液1 mL置于10，200 mL量瓶，用纯化水稀释定容，作为有关物质及含量供试品溶液。
2.1.4 供试品4（Gem 3 g+NS+AU）
Gem 3 g 溶解于NS 150 mL，同时膀胱热灌注过程中1 h约产生150 mL尿液。取注射用盐酸吉西他滨18瓶，用NS 900 mL和人工尿液900 mL溶解，得10 mg·mL-1GEM。溶液酸度和澄清度和颜色检查方法同“2.1.1”项。由于人工尿液中本身含有可见异物，样本不检查可见异物。精密量取样品溶液2 mL置于10 mL量瓶，用纯化水稀释定容，作为有关物质供试品溶液；精密量取样品溶液1 mL置于100 mL量瓶，用纯化水稀释定容，作为含量供试品溶液。
2.2 pH测定
参照2020年版《中国药典》四部[6]，取供试品溶液1，2，3，4，用已校的酸度计测定溶液的pH。每个供试品溶液取样3次测定。见表1。结果提示：GEM 2 g+NS，GEM 3 g+ NS在25 ℃恒温 6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h后，pH均稳定在（2.94±0.11）~（3.02±0.04），人工尿液的加入在一定程度上增加了改变了溶液的pH，GEM 2 g+ NS + AU、GEM 3 g+NS +AU在25 ℃恒温6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h后，pH在（3.10±0.04）~（3.16±0.02）。温度对供试品溶液的pH无显著影响。
2.3 溶液的澄清度与颜色
参照2020年版《中国药典》四部[7,8]。取供试品溶液1，2，3，4，分别置10 mL纳氏比色管中，作为供试管；另取所用溶剂、0.5号浊度标准液各5 mL分别置于其他2个配对的10 mL纳氏比色管中，作为对照管。每个供试品溶液取样3次测定。结果显示：GEM 2 g+NS，GEM 2 g+ NS+ AU 、GEM 3 g+ NS ，GEM 3 g+NS +AU 在25 ℃恒温 6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h后，均为无色澄清溶液。
2.4 可见异物
参照2020年版《中国药典》四部[9]，在光照度1 000～1 500 lx下，将供试品溶液1，2取样3次测定。结果显示：GEM 2 g+NS和 GEM 3 g+ NS在25 ℃恒温 6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h后，未见可见异物。
2.5有关物质和含量测定
2.5.1 色谱条件
盐酸吉西他滨高效液相色谱分析方法参考2020年版《中国药典》四部[10]和注射用盐酸吉西他滨检查方法[11]。
有关物质测定：色谱柱为Inertsil C8（250 mm×4.6 mm，5 μm），0.14 mol·L-1磷酸盐缓冲液（取磷酸二氢钠13.8 g与磷酸2.5 mL，加水溶解并稀释至1 000 mL，pH 2.5±0. 1）-甲醇（V∶V =97∶3）（A），0.14 mol·L-1磷酸盐缓冲液-甲醇（V∶V =50∶50）（B），进行梯度洗脱：0~8 min，100%A; 8~13 min，0%B→100%B；13~20 min，100%B；20~25 min，0%A→100%A；25~28 min，100%A。检测波长275 nm；进样体积20 μL，流速1 mL·min-1。
含量测定：色谱柱Waters XBridge C8（4.6 mm×250 mm，5 μm），以0. 14mol·L-1磷酸盐缓冲液-甲醇 (V∶V =97∶3) 为流动相等度洗脱；检测波长275 nm；进样体积20 μL；流速1mL·min-1。
2.5.2 溶液制备
（1）有关物质对照品：分别精密称取盐酸吉西他滨与胞嘧啶各50 mg置于250 mL量瓶，用纯化水溶解定容，取1 mL置于100 mL量瓶，用纯化水稀释定容。
（2）含量对照品：精密称取盐酸吉西他滨对照品40 mg置于100 mL量瓶，用纯化水溶解定容，取5 mL置于20 mL量瓶，用纯化水稀释定容。
（3）系统适用性：取盐酸吉西他滨对照品约10 mg，置于100 mL量瓶中，加168mg·mL-1氢氧化钾甲醇溶液4 mL，密封，超声溶解，在55 ℃水浴中加热16 h，冷却，用1%的磷酸溶液稀释至刻度，摇匀[11]。
2.5.3 系统适用性试验
分别取有关物质及含量系统适用性溶液进样。有关物质系统适用性图谱中，胞嘧啶、α-异构体、吉西他滨依次出峰，分别为3.2 min，5.6 min，8.2 min。吉西他滨的拖尾因子为1.05，吉西他滨峰与α-异构体峰之间的分离度为9.90，色谱图如图1。含量系统适用性图谱中，α-异构体峰与吉西他滨峰之间的分离度8.19，吉西他滨的拖尾因子1.4，色谱图如图2。
2.5.4 有关物质稳定性
有关物质胞嘧啶按外标法以峰面积计算，其余杂质按外标法以吉西他滨的峰面积计算，并将结果均乘以0.878 3。计算3个批号，每次检测3个样品的平均值。其中，α-异构体均未检出，其余结果见表2和表3。结果显示：GEM 2 g+NS，GEM 2 g+ NS+AU、GEM 3 g+ NS，GEM 3 g+NS+AU在25 ℃恒温 6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h后，有关物质中胞嘧啶最大值为（0.000 7±0.000 08）%，α-异构体未检出，最大未知单杂最大值为（0.03±0.009）%，总杂最大值为（0.04±0.03）%，符合2020年版《中国药典》中关于盐酸吉西他滨有关物质限量的要求。
2.5.5 含量稳定性
盐酸吉西他滨的含量为相对0 h平均含量的百分比。计算3个批号，每次检测3个样品的平均值，见表4。结果显示：GEM 2 g+NS，GEM 2 g+ NS+ AU、GEM 3 g+ NS，GEM 3 g+NS+AU在25 ℃恒温 6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h后，盐酸吉西他滨含量（98.85±0.75）%~（100.65±1.16）%（RSD≤ 1%）。因此，盐酸吉西他滨在室温（25 ℃）恒温6 h，37，43，45，47，50 ℃恒温2 h，在NS或NS和AU溶液中稳定性良好，可用于膀胱癌热灌注化疗。
3. 讨论
临床研究中常见膀胱灌注的药物主要是化疗药和免疫制剂，包括丝裂霉素C、表柔比星、吡柔比星、吉西他滨和羟基喜树碱、卡介苗和干扰素等[12,13] ；吉西他滨作为卡介苗膀胱灌注化疗耐药后的推荐药物，由于其相对分子质量小，清除快，降低了膀胱癌的复发率，安全性良好[14,15]，被纳入到国内外指南和专家共识 [16,17]。但吉西他滨经配置后的稳定性，尤其在HIVEC中经长时间较高温度循环后是否稳定，未见相关的研究报道。有研究分析吉西他滨膀胱热灌注治疗能够达到临床受益的原因可能是由于吉西他滨性质稳定，加热到 45 ℃条件下并未失活，并且在热灌注条件下与肿瘤细胞的结合加快，从而增加其活性及提高肿瘤细胞杀灭率[18]，但是研究中并没有对吉西他滨在加热条件下的稳定性做具体的分析，特别是膀胱中持续产生的尿液对药物稳定性的影响，以及药物在加热过程中杂质的热稳定性，都可能是导致吉西他滨有效性降低，毒性增加的因素，目前文献中未见相关报道，需要进一步研究，为吉西他滨的临床应用提供理论依据。
膀胱热灌注化疗的关键在于温度，时间，药物和容量。HIVEC临床应用的温度为43±2 ℃，时间为60 min。在本研究中，盐酸吉西他滨剂量选取临床常用的2 g和3 g，溶解于150 mL NS，保证膀胱的充盈及灌流液充分的冲刷膀胱表层[19]。同时，由于膀胱热灌注期间对膀胱的刺激性，出现尿频、尿急，导致人体在1 h内尿量会增加至100~150 mL，可能对药物的稳定性产生一定的影响。因此，本研究考察了HIVEC过程中，不同温度、灌注时间和人工尿液对吉西他滨稳定性的影响。本研究随机选取了3个不同批号的已上市注射用吉西他滨，参考2020年版《中国药典》对注射剂稳定性的重点考察项目，着重考察系统pH、可见异物、溶液澄清度、有关物质和药物含量的变化[20]。研究表明，吉西他滨在不同的温度中溶液的pH稳定、可见异物并未增加、溶液保持澄清透明、有关物质总量并未增加，药物含量稳定，提示吉西他滨热稳定性良好，是用于膀胱癌热灌注化疗的理想药物。
本研究中药物的热稳定性使用恒温水浴模拟HIVEC过程，在实际HIVEC治疗中，药物的含量可能会受到不同灌注系统的加热方式，灌注管道与药物的组织相容性或者物理粘附等影响，同时在临床治疗过程中，HIVEC持续的循环动力学及可能产生的癌组织脱落，可能对药物稳定性产生影响，仍有待进一步探索。综上，本研究结果首次为吉西他滨在HIVEC临床应用提供了热稳定性依据，吉西他滨是比较理想的膀胱热灌注治疗药物。
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