摘 要：目的：通过研究甘麦大枣汤对注意缺陷多动障碍(ADHD)模型动物自发性高血压大鼠(SHR)行为学变化、前额叶皮质层损伤的影响，探究本方治疗ADHD的作用机制与“脾藏意”理论的联系。方法：SHR大鼠随机分为甘麦大枣汤组(GMDZ组),利他林组(MPH组)和模型组(Model组),每组8只，另设8只韦斯达-京都大鼠(WKY)大鼠为空白对照组(Control组),适应性饲养7 d后，各组大鼠药物灌胃21 d。进行为期6 d的Morris水迷宫实验评估药物对SHR大鼠学习能力，冲动、多动行为的影响；通过苏木精-伊红(HE)染色、TUNEL染色观察大鼠前额叶皮质层病理形态变化。结果：空白对照组大鼠可见锥体细胞排列紧密，层次分明，结构有序，细胞形状规则，细胞核清晰可见，呈现深染，神经元细胞数量多，未观察到凋亡细胞；模型组大鼠见锥体细胞排列稀疏，层次不清，结构混乱，细胞形状不规则，细胞结构大多不清晰，神经元细胞数量较少，排列不齐，结构不完整，可见大量凋亡细胞；甘麦大枣汤组和利他林组可见锥体细胞排列较为紧密，层次比较分明，结构有序，细胞形状大多规则，细胞核多数清晰可见，呈现深染，神经元细胞数量尚可，排列比较整齐，结构较为完整，可见少量凋亡细胞。结论：甘麦大枣汤可以有效缓解ADHD模型SHR大鼠前额叶皮质层损伤，改善SHR大鼠关于ADHD的核心症状。
关键词：甘麦大枣汤 注意缺陷多动障碍 自发性高血压大鼠 脏躁 脾藏意 前额叶皮质层 细胞损伤
Effect of Ganmai Dazao Decoction on Cell Injury in Prefrontal Cortex of SHR Rats with Attention Deficit Hyperactivity Disorder
AN Jia-sheng ZHOU Zheng DANG Wei-li ZHANG Yong-hui SUN Xin SUN Yan-hong ZHANG Xiao-meng ZHANG Lu-lu GAO Shao-fang
Hebei University of Chinese Medicine;
Abstract：Objective: To study the effect of Ganmai Dazao Decoction on behavioral changes and prefrontal cortex injury in spontaneously hypertensive rats(SHR) with attention deficit hyperactivity disorder(ADHD), and to explore the relationship between the mechanism of Ganmai Dazao Decoction in the treatment of ADHD and the theory of "spleen governing idea".Methods: SHR rats were randomly divided into Ganmai Dazao Decoction group(GMDZ group), methylphenidate group(MPH group) and model group, with 8 rats in each group. Another 8 Wistar Kyoto rats(WKY) were set as the blank control group. After adaptive feeding for 7 days, rats in each group were perfused with medicine for 21 days. Morris water maze test was conducted for 6 days to evaluate the effects of drugs on learning ability, impulse and hyperactivity in SHR rats; The pathological changes of prefrontal cortex were observed by hematoxylin eosin(HE) staining and TUNEL staining. Results: In the control group, pyramidal cells were closely arranged, well-defined, orderly in structure, regular in shape, clearly visible and deeply stained nuclei, and a large number of neuronal cells and no apoptotic cells were observed; In the model group, the pyramidal cells were sparsely arranged, the layers were unclear, the structure was chaotic, the cell shape was irregular, the cell structure was mostly unclear, the number of neuronal cells was small, the arrangement was uneven, the structure was incomplete, and a large number of apoptotic cells were seen; In GMDZ group and MPH group, pyramidal cells were closely arranged, with clear layers and orderly structure, most of the cells were regular in shape, most of the nuclei were clearly visible, showing deep staining, the number of neuronal cells was acceptable, the arrangement was relatively neat, the structure was relatively complete, and a small number of apoptotic cells could be seen. Conclusion: Ganmai Dazao decoction can effectively alleviate the injury of prefrontal cortex and improve the core symptoms of ADHD in SHR rats.
Keyword：Ganmai Dazao Decoction; ADHD; SHR rats; Visceral irritability; spleen governing idea; prefrontal cortex; cell injury;
根据DSM-5(精神障碍诊断与统计手册第五版),注意缺陷多动障碍(ADHD)是指主要发生于儿童时期，表现为持续注意力不集中，活动过度，冲动、多动，导致学习、交流甚至工作困难为主要特征的精神障碍综合征。目前ADHD已经是最常见的一种精神障碍[1]。然而关于ADHD确切病因目前仍不清楚，目前在多种假说中以“多巴胺能神经传递异常”较为公认，其中多巴胺受体D1(DRD1)与多巴胺受体D2(DRD2)常作为多巴胺能神经传递功能的检测指标。西医治疗主要采用兴奋中枢神经类药物利他林，但因其主要成分为苯丙胺类衍生物，故存在食欲下降、失眠、腹痛等副作用，且停药后症状反跳明显。中医并无与ADHD完全对应的病名，一般在属“脏躁”治疗范畴[2],且有不可替代的优势[3]。根据症状，其病因可归纳为先天禀赋不足、后天调护不当、脏腑功能失常、阴阳平衡失调所致，其主要病变在心、肝、脾、肾。治疗基本原则为补虚泻实、调理阴阳、平衡脏腑等。根据不同证候类型，分别给予清热化痰、健脾养心、清心平肝、滋水涵木、抑木扶土等治法[4]。同时还可以配合中成药、针刺疗法等治疗，结合患儿具体情况对其进行心理教育，行为矫正等综合训练治疗[5]。
根据课题组前期临床研究发现，患者中医分型以脾虚证最为常见[6],因此本实验决定从“脾藏意”角度入手，通过检测大鼠肠道菌群的分布来探究脾功能对ADHD的影响。《素问·宣明五气篇》云：“心藏神，肺藏魄，肝藏魂，脾藏意，肾藏志。”脾的功能直接影响“意”,故脾功能与人的精神状态有密切的联系。从生理学的角度观察得到，胃肠道的肽类分泌细胞和脑内的肽类神经元在胚胎发生上是共同起源于神经外胚层。脑主宰了内分泌系统，又是激素的作用目标之一。脑肠肽这一物质的发现表明，大脑和消化道之间在起源和功能上有密切关系，同时还意味着在外周大脑外的递质能产生大脑内递质类似的功能[7]。这为解释“脾藏意”的现代机制提供了证据和线索。课题组从“脾藏意”理论入手，选取《金匮要略》中的治疗“脏躁”的主要方剂甘麦大枣汤作为研究药物，遵循“肝苦急，急食甘以缓之”的治法，从脾着手，用甘润之剂调补脾胃，以滋诸脏气阴[8]。
前额叶皮质对调控目的性行为有重要的作用，与记忆、注意、人格发展有密切联系。在ADHD的发病中，前额叶皮质的功能异常也发挥着重要作用。有影像学实验表明[9],在核磁共振成像检查下，ADHD患儿前额叶皮质层区域激活明显减少，且白质纤维完整性与正常儿童有所区别。另有试验表明[10],近红外光谱成像显示下，ADHD患儿存在前额叶皮质功能受损，以左侧更为严重。有动物实验研究表明[11],自发性高血压大鼠(SHR)与对照组相比，前额叶皮质层细胞凋亡率明显提高，差异有显著性。这都表明了前额叶皮质层功能的正常与否可能对ADHD的发病有着重要影响。故本课题组选用目前最为公认的SHR大鼠作为实验组，利他林作为对照药物，选取前额叶皮质层HE染色与TUNEL染色作为检测指标，观察给药后各组大鼠行为学与上述各项指标的变化，探究本方治疗ADHD的作用机制。
1 材料
1.1 动物
SHR雄性大鼠24只，WKY雄性大鼠8只，均为SPF级，4周龄，购置于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号SCXK(京)2016-0006。于河北中医学院橘泉校区进行饲养，适应性饲养7 d, 自然光照，自由进食饮水。
1.2 主要药物
甘麦大枣汤药物全部购置于河北中医学院国医堂中药房，所有颗粒由神威药业提供，批号甘草20052741、小麦20081721、大枣20080411。中药颗粒溶液按照生药量甘草10 g, 小麦15 g, 大枣10 g配制而成， 甘麦大枣汤组按照每只每天7.3 g/kg剂量进行药物灌胃。利他林片(18 mg×15片),购置于河南中医药大学第一附属医院药房，药物批号(9LE783A)。加入生理盐水配置成利他林溶液，利他林组按照每只每天0.02 mg/kg剂量进行药物灌胃。
2 方法
2.1 分组方法
24只4周龄雄性SHR大鼠，按照随机数字表法随机分为甘麦大枣汤组(GMDZ组)8只，利他林组(MPH组)8只，模型组(Model组)8只； 8只4周龄雄性WKY大鼠设置为空白对照组(Control组)。
2.2 动物给药方法
根据9周岁儿童体表面积和4周龄大鼠体表面积换算后得出各组大鼠每只每天灌胃量为1.5 mL/100 g, 每天早晨9:00进行称重，根据大鼠当日体质量调整灌胃量。甘麦大枣汤组、利他林组分别给予对应药物，模型组与空白对照组给予等量生理盐水。每日定时灌胃1次，累计灌胃21 d。
2.3 Morris水迷宫试验
灌胃21 d后，各组大鼠进行Morris水迷宫实验。以平台所在象限对面象限作为起始象限，依次将大鼠面向壁沿放入水池中，每次测试时间为120 s, 若大鼠登上平台且停留时间到达5 s, 则记录自动停止并记为逃避潜伏期，休息10 s后开始下一象限测试；若未找到平台，则逃避潜伏期记为120 s, 将大鼠引导至平台处停留10 s, 以便其记忆平台位置，后开始下一象限测试。逃避潜伏期为测试大鼠注意力与学习能力指标。第6 d时移除平台，于原平台对角象限将所有大鼠面向壁沿放入水池中，记录其120 s内穿越平台次数、平台象限停留时间、平均速度与规定时间内总路程，以评估其冲动多动行为。
2.4 前额叶皮质层病理形态观察
大鼠使用2%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉，打开胸腔后使用10%多聚甲醛溶液进行心脏灌注，待大鼠尾部伸直僵硬后使用断头器断头，于冰盘上迅速剥离出大脑，放入10%多聚甲醛溶液中固定。后经不同浓度乙醇逐级脱水，浸腊包埋，使用切片机制作成石蜡切片，分别用于苏木精-伊红染色以及TUNEL染色，观察大鼠前额叶皮质层细胞损伤情况。
2.4.1 HE染色：
(1)切片，多聚甲醛溶液中的脑组织取出后，石蜡包埋并切片，厚度4 μm; (2) 脱蜡，将切片放入二甲苯(I)溶液内浸泡10 min; 取出后放入二甲苯(II)溶液10 min; (3)水化，将脱蜡后的切片放入无水乙醇中浸泡清洗5 min, 取出后再依次放入95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中浸泡清洗5 min, 取出后用蒸馏水将乙醇清洗干净； (4)苏木精染色，切片自然晾干，放入苏木精中浸泡5 min染色，取出后用蒸馏水进行清洗3 s左右； (5)分化，将切片放于1%盐酸乙醇中进行分化，清洗之后浸泡于蒸馏水中5 min; (6)脱水，将切片依次放入50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、100%乙醇中分别浸泡5 min; (7)伊红染色，将切片放入伊红染料中5 min进行染色，后取出放入无水乙醇中将伊红染料洗净； (8)透明，将切片放入二甲苯(I)溶液5 min后取出放入二甲苯(II)溶液5 min; (9)封片，用中性树脂封固切片，过程中避免产生气泡； (10)图像采集，DP73型数码显微镜下观察前额叶皮质层细胞损伤情况，拍照并记录。
2.4.2 TUNEL染色：
(1)将脑组织从多聚甲醛溶液中取出，石蜡包埋后切成厚度为4 μm的常规切片； (2)将切片依次放入二甲苯(I)溶液内浸泡10 min, 取出后放入二甲苯(II)溶液10 min脱掉石蜡；(3)将脱蜡后的切片依次放入无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇中各浸泡5 min, 洗净二甲苯溶液，再放入蒸馏水中； (4)蛋白酶K处理组织，37 ℃湿润反应20 min; (5)PBS漂洗2次，每次5 min; (6)甩去PBS,擦干组织后，每个样本加入50 μL的TDT酶工作液，37 ℃避光湿润反应60 min。
2.5 统计学方法
所有结果数据使用SPSS25.0软件进行统计分析，计量资料使用均数±标准差(x¯±s)表示，符合正态分布的，多组间数据比较使用单因素方差分析，2组间数据比较使用SNK法检验。不符合正态分布或方差齐性的，多组间数据使用非参数性检验。所有数据结果均以P<0.05为差异有显著性。
3 结果
3.1 大鼠学习能力、冲动多动行为的比较
与空白对照组相比，模型组平均潜伏期时间明显延长，差异有显著性(P<0.05);与模型组相比，甘麦大枣汤组和利他林组平均潜伏期缩短，差异有显著性(P<0.05)。与空白对照组相比，模型组目标象限停留时间缩短，穿越平台次数减少，平均速度加快，总路程延长，差异有显著性(P<0.05);与模型组相比，甘麦大枣汤组和利他林组目标象限停留时间延长，穿越平台次数增多，平均速度减慢，总路程缩短，差异有显著性(P<0.05)。详见表1。
表1 各组大鼠Morris水迷宫试验的比较 (x¯±s)
3.2 大鼠前额叶皮质层病理形态观察的比较
3.2.1 大鼠前额叶皮质层HE染色结果：
由图1可见，镜下观察空白对照组前额叶皮质层，可见锥体细胞排列紧密，层次分明，结构有序，细胞形状规则，细胞核清晰可见，呈现深染，神经元细胞数量多，排列整齐，结构完整； 镜下观察模型组前额叶皮质层，可见锥体细胞排列稀疏，层次不清，结构混乱，细胞形状不规则，细胞结构大多不清晰，神经元细胞数量较少，排列不齐，结构不完整； 镜下观察甘麦大枣汤组前额叶皮质层，可见锥体细胞排列较为紧密，层次比较分明，结构有序，细胞形状大多规则，细胞核多数清晰可见，呈现深染，神经元细胞数量尚可，排列比较整齐，结构较为完整； 镜下观察利他林组前额叶皮质层，可见锥体细胞排列较为紧密，层次比较分明，结构有序，细胞形状大多规则，细胞核多数清晰可见，呈现深染，神经元细胞数量尚可，排列比较整齐，结构较为完整。
3.2.2 大鼠前额叶皮质层TUNEL染色结果：
由图2可见， 镜下观察空白对照组前额叶皮质层， 多见TUNEL阴性细胞， 表现为核着浅蓝色， 细胞界限不清且疏散； 镜下观察模型组前额叶皮质层， 可见大量TUNEL阳性细胞即凋亡细胞， 表现为细胞核固缩，胞体缩小，形状不规则且浓染呈现深褐色； 镜下观察甘麦大枣汤组前额叶皮质层， 多见TUNEL阴性细胞， 可见少量TUNEL阳性细胞； 镜下观察利他林组前额叶皮质层， 多见TUNEL阴性细胞。可见少量TUNEL阳性细胞。TUNEL阳性细胞率由高到低依次为： 模型组 、甘麦大枣汤组与利他林组、 空白对照组。
4 讨论
ADHD是一种儿童时期比较常见的精神障碍类疾病，主要症状表现为与年龄不相符的注意力不集中、冲动多动的等行为障碍。其发病机制尚未被完全阐明，目前较为公认的理论为多巴胺缺陷致病假说，治疗以兴奋中枢神经类药物利他林为主。但利他林作为苯丙胺类药物，有明显的成瘾性及副作用，中医中药在此方面有明显优势。ADHD在古代中医并无对应疾病，根据其症状表现，目前中医一般从“脏躁”等入手，脏腑辨证以心肝火旺兼有脾虚为主。课题组根据《中医儿科临床诊疗指南·儿童多动症》《金匮要略》及《素问·宣明五气篇》,治疗上选择“补脾”为入手点，以“脾藏意”理论为支撑，方用甘麦大枣汤作为实验药物。甘草味甘性平，归心、肺、脾、胃经，有补脾益气，调和诸药等功效； 小麦味甘，微寒，归心经，有养心除烦的功效； 大枣甘温，归脾、胃、心经，有补中益气，养血安神的效果。“心病者宜食麦”(《灵枢·五味》),本方遵循“肝苦急，急食甘以缓之”(《素问·脏器法时论》)的治法，用甘润之剂调补脾胃，以滋诸脏气阴，清心肝之火。网络药理学研究表明[12],甘麦大枣汤中的山柰酚可以保护神经，改善认知功能障碍。
“脾藏意”的理论来自《素问·宣明五气篇》。王冰在对“脾藏意”的注释为“记而不忘者”,又对“意之所存谓之志”作出“专注而不移者”的注解。表明此处的“意”有记忆、思维与注意等含义，若“意”不正常，则会出现注意力不集中、记忆下降、冲动等ADHD的核心症状。“脾藏营，营舍意”则体现了“意”的正常全赖于脾运化水谷精微，化生营气，以营养意的生理功能。因此，本课题组以此理论为支点，认为“意”的正常与否受脾的功能影响。
Morris水迷宫行为学实验结果表明，甘麦大枣汤组逃避潜伏期较模型组明显缩短，穿越平台次数增多，目标象限停留时间延长，平均速度与规定时间内总路程都明显下降，证实了甘麦大枣汤能有效改善SHR大鼠的学习能力与空间探索能力，对其核心的注意力不集中、冲动多动等症状有明显缓解。
本研究结果表明，与空白对照组相比，模型组大鼠前额叶皮质层中的细胞凋亡的阳性率均有显著提高。甘麦大枣汤组与利他林组相比，前额叶皮质层的细胞凋亡无明显差异，且较空白对照组同样无明显差异，与模型组相比细胞凋亡的阳性率明显下降。进一步确认了ADHD的发病伴随着前额叶皮质层的损伤，甘麦大枣汤可以有效改善细胞的受损情况。
综上本研究结果证明，甘麦大枣汤可以有效改善SHR大鼠关于ADHD的核心症状，减少前额叶皮质层细胞损伤与细胞凋亡，证明本方对ADHD有一定的治疗效果，进一步丰富和发展了“脾藏意”理论的内涵，为ADHD的中医治疗提供新的思路。
参考文献
[1] 李娇，廖永州.中药治疗小儿多动症临床及实验研究进展[J].湖北中医杂志，2013,35(12):74-76
[2] 杨曼，吕玲玲，周正，等.周正治疗儿童情志病经验[J].中医药临床杂志，2020,32(12):2 253-2 255
[3] 韩新民，袁海霞，杨江，等.儿童多动症中医学研究现状分析[J].中华中医药学刊，2020,38(2):4-7
[4] 陈革.小儿多动症的中药治疗[J].中国医药指南，2018,16(34):175-176
[5] 马方圆，王晓英.儿童多动症诊断的研究进展[J].中国科技信息，2012(18):105
[6] 周荣易，马丙祥，周正，等.儿童孤独症谱系障碍180例中医证型分布及规律探讨[J].中国中医基础医学杂志，2021,27(3):476-479
[7] 刘来彪，杨振宁，黄珊珊.中医对心脾与心理活动关系的认识[J].山东中医杂志，2011,30(7):461-463
[8] ZHOU Y,MILHAM M,ZUO X N,et al.Functional homotopic changes inmultiple sclerosis with resting-state functional M R imaging [J].AJNR Am J Neuroradiol,2013,34(6):1 180-1 187
[9] 郭丽华，李翠萍.“脏躁”辨析[J].河南中医，2009,29(2):113
[10] 兰红艳，吴丹，汪秀莲，等.基于近红外光谱的注意缺陷多动障碍患儿前额叶皮质功能研究[J/OL].中国儿童保健杂志：1-4[2021-01-15].
[11] 阎樱，王亚萍.哌醋甲酯对ADHD动物模型SHR大鼠前额叶皮质层细胞凋亡的影响[J].中国妇幼健康研究，2016,27(12):1 450-1 452
[12] 晏仁义，陈衬心，李赫宇，等.基于网络药理学研究甘麦大枣汤改善睡眠障碍的作用机制[J].中成药，2020,42(2):343-350
