摘 要：氧化应激状态被认为与口腔潜在恶性疾患（oral potentially malignant disorders,OPMD）的发病机制及恶性转化有关。抗氧化微量营养素具有预防、抑制和逆转口腔癌发生的潜力，维持抗氧化微量营养素的浓度在适当范围内对治疗相关疾病具有重要意义。本文就微量营养素的抗氧化作用机制与OPMD发生、发展及治疗相关的研究进展作一综述。
关键词：口腔潜在恶性疾患 微量营养素 氧化应激
Research progress of antioxidant mechanism of micronutrients in oral potentially malignant disorders
ZHOU Yong LIN Xiaoping
Department of Stomatology,Shengjing Hospital of China Medical University;
Abstract：Oxidative stress is considered to be related to the pathogenesis and malignant transformation of oral potential malignant diseases(OPMD). Antioxidant micronutrients are potential in preventing, inhibiting and reversing the occurrence of oral cancer.Therefore, maintaining an appropriate range of antioxidant micronutrient concentrations is of important significance for the treatment of related diseases. This article reviewed the research progress on the antioxidant mechanism of micronutrients and the occurrence, development and treatment of OPMD.
Keyword：oral potentially malignant disorders; micronutrient; oxidative stress;
氧化应激（oxidative stress,OS）是指体内活性氧（reactive oxygen species,ROS）形成和抗氧化防御之间平衡受损的状态，参与口腔扁平苔藓（orallichenplanus,OLP）、口腔白斑（oral leukoplakia,OLK）和口腔黏膜下纤维化（oral submucous fibrosis,OSF）等口腔潜在恶性疾患（oral potentially malignant disorders,OPMD）的发生。机体对OS的防御可以通过微量营养素（矿物质和维生素）的抗氧化活性和酶的相互连接系统来完成，可清除、抑制自由基的形成或修复自由基造成的损伤来保护机体免受OS的影响，在一定程度上避免疾病的发生[1]。近年来，随着微量营养素研究手段的不断提升，越来越多的证据表明，OPMD和抗氧化微量营养素之间存在联系。本文就微量营养素的抗氧化机制与OPMD的相关性和治疗潜力等方面进行探究。
1 矿物质在OPMD中的抗氧化作用
1.1 锌
锌（Zn）是维持口腔健康的必需微量元素，除在牙菌斑、唾液和牙体硬组织中存在外，口腔黏膜也是锌的“口腔储库”之一[2]。锌在细胞生长和增殖、维持正常免疫功能、胶原合成和伤口愈合中发挥着关键作用[3]。
越来越多的研究发现，缺锌可导致OPMD发病率增加[4]。OSF患者普遍存在锌含量减低的情况，这可能与口腔黏膜在纤维化、炎症及中和过量自由基等过程中，锌需求量增加有关[5]。研究发现，锌在治疗和预防OSF恶变中具有一定的积极作用：(1)锌是天然抗氧化剂超氧化物歧化酶（即铜锌蛋白复合物）的辅因子，该酶在OSF中具有抗癌活性；(2)锌会降低含铜赖氨酰氧化酶（lysyl oxidase,LOX）的活性，抑制胶原沉积，并通过胶原酶和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMPs）促进病理性胶原降解，显著改善张口度及黏膜对刺激性食物的敏感程度；(3)锌能提高细胞内谷胱甘肽水平，介导维生素A和维生素C有效发挥抗氧化活性以维持上皮的完整性，减轻口腔黏膜的烧灼感[6-7]。也有学者指出，锌通过调控免疫反应和OS反应来保护口腔黏膜屏障免受伤害[8]。细胞毒性T细胞的激活、MMPs的活化、环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2）的表达增加以及氧化-抗氧化状态失衡被认为是OLP的常见发病机制[9]。一方面，MMPs是一种依赖锌的蛋白水解金属酶，锌不仅能够阻止MMP-1的激活，抑制T淋巴细胞在OLP中的积累，还能下调MMP-9的表达，抑制Ⅳ型胶原成分的降解，从而维持基底膜的完整性[10]；另一方面，锌被证明能清除细胞内ROS，后者下调COX-2的表达，并抑制前列腺素E2(prostaglamdin E2,PGE2）的释放，提示补锌能有效抑制患者机体的OS反应并减轻涉及COX-2和PGE2途径的炎症反应，改善OLP患者的炎症状态[11]。
1.2 铜
铜（Cu）存在于多种氧化酶（酪氨酸酶、铜蓝蛋白、胺氧化酶、细胞色素氧化酶）中，是维持细胞稳态的重要组成部分，参与多个生物过程[12]。铜通常与蛋白质结合，可以被释放出来，成为游离铜，催化高活性羟基自由基的形成，增加脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤。铜缺乏会影响抗氧化酶（如铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Zn superoxide dismutase,CuZn-SOD)(SOD1））的形成，降低机体应对OS的能力[13]。
多项研究发现，OPMD和恶性肿瘤（如鳞状细胞癌）会诱发OS状态，血清和唾液中的铜含量均明显升高[6,14]。OSF患者患口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma,OSCC）的风险较高，且具有更高的侵袭性、转移率和复发率，而铜的血管生成和抗氧化能力在OSF的发生和癌变过程中起重要作用[15-17]。市售槟榔制品中含有高铜成分，在咀嚼过程中铜与口腔黏膜角质形成细胞直接接触，以被动扩散的方式进入上皮细胞后，一部分与金属硫蛋白结合，另一部分通过基底膜转移进入组织，铜在摄入短短15 min内就会出现在血液中，还会在唾液中存留较长时间（长达30 min），可溶性铜含量的增加能够上调LOX的活性来促进胶原纤维的增生，表明铜是OSF的一种致病因素[18]。随着血清和唾液中铜水平的增加，OSF的组织学分级也随之增加[12,18]，可能的原因有：一方面，铜可以激活几种血管生成因子（VEGF、TNF-α、IL-1、b-FGF）与内皮细胞结合，诱导细胞从G0期进入到G1期，促进细胞增殖；另一方面，血清中高浓度的铜能够诱导ROS和OS,ROS可以刺激c-fos和c-jun等早期生长相关基因的表达，促使细胞有丝分裂活性增加造成口腔黏膜组织损害。在OSF恶变过程中，除血清铜中游离态的铜增加外，铜蓝蛋白（ceruloplasmin,CER）（主要的铜转运蛋白）以及SOD1活性也随之增加，这两项指标的升高均与清除自由基有关，而唾液铜升高的局部效应可能比血清水平升高起更重要的作用，上述均提示了铜直接或间接地参与癌变过程[12,17]。OPMD和OSCC患者血清铜含量的增加可能是由于铜蛋白酶、CER升高和铜的分解代谢减少所致，其中CER水平在恶性进展过程中会增加4～8倍，进一步表明在OS的发生过程中，机体的抗氧化保护机制也同时启动[12]。铜的抗氧化能力主要是通过影响含铜抗氧化酶的活性来实现的，一项动物实验发现，铜缺乏会使血清中谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）、SOD1及CER的活性下降，脂质过氧化物（LPO）及丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量增加，导致机体抗氧化能力降低，经蛋氨酸铜40 mg/kg补充治疗40 d后上述指标均有所改善[19]。在针对OLP患者血清中差异蛋白的初期筛选过程中发现，抗氧化蛋白质CER的表达量明显增加；此外，CER也是合成SOD1所需铜离子的来源之一，研究表明，SOD1表达增加的小鼠循环中CER和铜浓度减低[12,20]。在此背景下，铜螯合疗法作为一种新的抗癌策略被提出。有学者指出，铜螯合剂不仅能够通过降低血清中游离铜离子水平直接抑制ROS引发的细胞增殖，还能通过螯合SOD1中活性催化中心的Cu2+使其失活，降低过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）浓度，抑制失控的胞内ROS-MAPK信号转导通路，进而间接地控制细胞过度增殖和癌变的发生，并通过抑制NF-κB介导的促血管生成因子（包括VEGF、FGF2、IL-1α、IL-6和IL-8等）相关基因的转录活性以及MMP-9的表达来抑制血管生成，减少细胞外基质降解和肿瘤侵袭扩散[21-22]。但关于抗铜疗法在抑制肿瘤生长和血管生成方面的研究目前仅限于炎症性乳腺癌小鼠模型和伴有严重免疫缺陷小鼠头颈部鳞状细胞癌模型，因此，降低铜水平是否在OPMD中具有良好的化学预防作用仍是未来研究的方向[17,22]。同时学者们更应该探寻一个合适的维持细胞正常生理功能的Cu2+浓度范围，因为铜过高或过低都会引发严重的疾病，段晓东等[23]发现微摩尔级浓度（1×10-6～1×10-5mol/L)Cu2+产生的ROS在达到34.29%～40.47%时表现出明显的促人角质形成细胞（human keratinocyte cell,HaCat）增殖效应。
1.3 硒
硒（Se）是多种硒蛋白的关键活性成分，其中GSH-Px和硫氧还蛋白还原酶（TrxRs）是硒蛋白家族中主要的抗氧化剂[24]。硒蛋白存在于许多细胞器或细胞区室中，其具有特定的组织分布和对硒水平变化的敏感性[25]。已有的研究表明，低硒水平引起的硒蛋白活性降低与癌症风险增加息息相关[26]。
早期在一项对伊拉克扁平苔藓（lichen planus,LP）患者的研究中观察到，血清硒水平与LP病损的持续时间和严重程度呈负相关[27]。世界卫生组织（World Health Organization,WHO）将OLP归类为癌前病变，提示其具有向鳞状细胞癌转变的潜力[28]。Khanna等[29]研究发现癌症组血清硒含量较癌前组明显降低，提示在癌变过程中，硒发挥了全面的保护性抗氧化作用。OLP患者体内的低硒水平可使体内谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX-1）活性降低，导致其无法清除由线粒体超氧化物歧化酶2(superoxide dismutase 2,SOD2）歧化反应产生的H2O2，促使癌细胞转化为更具侵袭性的表型，增加了OLP癌变风险[30]。硒在调节宿主免疫和抗OS方面发挥着重要作用。一项随机对照临床试验发现，硒（外用制剂和全身给药）治疗糜烂型OLP 6周时的疗效与外用皮质类固醇相当，但随着随访周期的延长（12周），硒治疗似乎更有优势：疗效维持时间更长，止痛效果更佳，其具有的抗真菌作用还能有效避免局部皮质类固醇使用后的副作用，即继发性念珠菌病[24,31]。从机制上讲，一方面，补硒可以抑制NF-κB蛋白与炎性介质基因启动子的结合，降低炎性细胞因子TNF-α、IL-1、IL-6的表达，从而减轻OLP病损的炎症状态；另一方面，补硒可通过调节CD3+/CD4+和CD4+/CD8+的表达以及维持Th1/Th2平衡来恢复细胞免疫的正常功能状态，进而避免OLP的反复波动[24,32]。在OLP中存在高OS状态，过量的ROS会在以CD4+T淋巴细胞为主要炎性细胞浸润的情况下加剧炎症反应，破坏角质形成细胞的脂膜，导致更严重的局部组织破坏和ROS产生，形成恶性循环。硒在治疗OLP时可通过清除H2O2和有机过氧化物来保护口腔黏膜免受损伤[24]。
2 维生素在OPMD中的抗氧化作用
2.1 维生素A和维生素E
脂溶性维生素A是一组有机化合物，包括视黄醇、视黄酸、维甲酸和维生素A原（类胡萝卜素），在降低上皮角化率、抗炎、抗氧化和免疫调节方面具有关键作用[4,33]。维生素E，特别是α-生育酚，除在谷胱甘肽过氧化物酶途径中起抗氧化剂的作用外，它还可以通过清除脂质过氧化链式反应中产生的有害自由基，保护细胞膜免受氧化损伤[33]。虽然维生素A和维生素E均能够有效抑制细胞膜脂质过氧化，但两者的联合使用却有一定的拮抗作用[34-35]。
流行病学研究表明，非酶类抗氧化剂（维生素A、维生素E）缺乏会增加OLK、糜烂型OLP等OPMD的易感性，且随着疾病病程的进展，其含量逐渐降低[36-37]。由烟草和槟榔相关的致癌物及促进剂（如亚硝胺、儿茶酚和槟榔碱等）产生的自由基和ROS被认为是OPMD患者体内MDA升高的原因。脂质过氧化物对口腔黏膜组织产生的细胞毒性和遗传毒性效应能够导致口腔黏膜组织遭受OS损害，经证实，脂质过氧化物含量越高，正常细胞转变为突变细胞的数量越多，从而导致OPMD患者疾病严重程度的加重[38]。维生素A和维生素E等抗氧化剂被证实可以降低脂质过氧化程度，而其水平的降低以及由此对组织产生的氧化损伤可能在口腔黏膜癌变过程中起着重要作用。研究显示，胡萝卜素的抗氧化作用可能会导致癌前病变的消退或抑制其发展为癌症[38]。早期一项印度OLK患者的干预试验显示，在烟草和槟榔来源的致癌物持续存在期间，服用低剂量抗氧化维生素A或β-胡萝卜素6个月后能够有效缩小病损面积、抑制新发病损并降低颊黏膜细胞微核和核结构损伤的发生率，提示维生素A或β-胡萝卜素可以降低口腔黏膜癌变风险[39]。此外，口服阿维A酸（9-顺式维甲酸）（30 mg，每日1次）对常规治疗无效的严重OLP患者有显著的临床疗效且副作用更少[40]。维甲酸对癌前细胞的抑制作用除抗氧化作用外，可能还与其直接激活维甲酸受体（RARs和RXRs）或抑制激活蛋白-1(AP-1）的活性有关，但口腔黏膜异常增生细胞是否同口腔鳞癌细胞系一样存在维甲酸抵抗还需进一步研究[41]。相关研究也指出，α-生育酚的强抗氧化作用能使体内自由基、脂质过氧化产物和某些微量元素水平改变，从而消除口腔癌前状态下产生的自由基[42]。一项关于14种中草药衍生物随机临床试验进行的网络荟萃分析（NMA）也支持了上述观点，该研究认为番茄红素与维生素E联合应用在治疗OSF方面效果最好（治疗评分P-SCORE=0.958 6)[43]。
然而，维生素A相关化合物治疗OPMD所产生的疗效并不持久，全身应用维生素A所产生的毒性反应成为其使用的主要限制因素。其中口腔黏膜不良反应主要包括唇炎、口腔黏膜炎、口干症、胡萝卜素血症（由于色素过度沉积导致黏膜变黄）和愈合障碍。因此能有效治疗和预防肿瘤的维生素A类临床一线药物还有待进一步探索[44]。
2.2 维生素C
维生素C(L-抗坏血酸）是一种水溶性维生素，也是一种重要的天然抗氧化剂，它能与有机自由基反应，保护生物膜免受自由基损伤[45]。维生素C与维生素E有协同作用，当维生素E转化为生育酚而失去抗氧化能力时，维生素C可将生育酚（α-生育酚的一种氧化形式）还原为α-生育酚，起到激活维生素E的作用[46-47]。在致癌和致突变过程中，ROS和氮物种会对DNA造成氧化损伤。相对于其他唾液生物标志物而言，联合使用8-羟色胺、MDA、维生素C和维生素E来区分OPMD与正常健康组织的敏感性和特异性明显高于单独使用生物标记物的方法，目前该技术已经被提出用于口腔癌前病变和癌症的早期检测[48]。
维生素C在水中的溶解性使其具有在细胞内外发挥对抗自由基作用的优势，可以保护宿主细胞免受感染引起的OS[49]。Nicolae等[49]研究发现与无感染的LP患者相比，伴感染的LP患者尿中维生素C浓度显著降低，且随着病程的加重，维生素C浓度逐渐降低。此外在动物模型中发现，吞噬细胞和淋巴细胞中的抗坏血酸浓度明显高于细胞外液中抗坏血酸的浓度，进一步证明了维生素C可增强宿主细胞对感染的抵抗能力[49]。Abdolsamadi等[34]研究发现，在排除了年龄和性别等混杂因素后，OLP患者唾液中MDA明显升高，总抗氧化能力（TAC）以及抗氧化维生素A、C和E明显降低，并出现糜烂型病损，提示OS的增加和抗氧化防御能力的降低是糜烂型OLP易感性的潜在决定因素。另外，维生素C还可作为代谢途径的中间产物参与到OS过程中，促进代谢重排和肿瘤进展，维生素C水平降低激活了ROS和OS的发生，高水平的OS导致核酸（8-羟基脱氧鸟苷）、蛋白质（蛋白质羰基）和脂质（8-异前列腺素F2α）及其代谢标志物（葡萄糖、总胆固醇和总蛋白）的氧化损伤，使癌细胞具有更强的侵袭性，并启动细胞分裂以促进疾病的发展[50]。
维生素C会根据浓度梯度的不同在口腔环境中发挥双重作用。生理浓度的维生素C可以减轻自由基和活性中间体产生的有害影响。然而，近年来发现它还具有双峰活性，在高浓度的情况下，维生素C可以通过还原过渡金属在体内加剧OS，起到促氧化剂的作用[49]。维生素C的促氧化理论显示，H2O2的生成量会随着维生素C含量的增加而增加，具有强氧化性的H2O2能够诱导癌细胞的DNA损伤，启动癌细胞死亡[51]。
2.3 其他维生素的抗氧化作用
2.3.1 维生素B复合体
维生素B复合物由8种水溶性成分组成：硫胺素（VB1）、核黄素（VB2）、烟酸（VB3）、泛酸（VB5）、吡哆醇（VB6）、生物素（VB7）、叶酸（VB9）和钴胺（VB12），它们在蛋白质、脂质和核酸合成，新陈代谢和免疫防御等方面相互联系，相互配合[52]。每种维生素B都被证明有较强的抗氧化能力[52]。Chen等[53]发现，血红蛋白、铁或维生素B12缺乏以及血同型半胱氨酸水平异常升高与OLP有显著关联，且糜烂型病损平均血同型半胱氨酸水平更高。铁、维生素B12缺乏可导致贫血，由于血红蛋白的降低，血液向口腔黏膜组织输送氧气的能力亦下降，最终导致口腔黏膜萎缩。糜烂型OLP患者较高的血同型半胱氨酸水平会引起OS，增加口腔上皮细胞供血小动脉的血栓形成，进而破坏口腔上皮屏障，从而增加糜烂型OLP的发生频率。研究发现，OLP患者的高血同型半胱氨酸水平可能与维生素B6、B12以及叶酸缺乏有关，该指标的升高已作为判断维生素B复合体参与抗氧化应激的重要标志[53]。虽然在大多数情况下，复合维生素的经验性补充在一定程度上能够改善患者的主观症状，但调查显示维生素B1、B6、C、叶酸、胡萝卜素的缺乏并不是OLP的主要致病因素，一些研究发现在强化补充复合维生素的两个月中，无患者得到完全恢复[54]。
2.3.2 维生素D
维生素D是一种脂溶性维生素，其亚型7-脱氢胆固醇、胆钙化醇、维生素D2和骨化三醇能够通过减少脂质过氧化表现出抗氧化特性[55]。已有的研究证实，维生素D缺乏与OLP风险增加密切相关[56]。1,25-二羟基维生素D3(1,25(OH)2D3）是维生素D的活性形式，其生物学功能主要受特异性核激素受体维生素D受体（vitamin D receptor,VDR）的调节，VDR在多种组织的上皮细胞中均有显著表达[56]。在体外培养的HaCat细胞模型中证实，依赖维生素D受体的1,25(OH)2D3能够通过调节NF-κB信号通路来对抗脂多糖诱导的炎性细胞因子过度表达来减缓OLP的炎症过程[56-57]。与此同时，维生素D在降低黏膜DNA氧化损伤方面也发挥着重要作用。研究发现，补充外源性维生素D能够显著改善溃疡性结肠炎患者血清中OS指标（氧化型低密度脂蛋白、过氧化脂质、MDA和超氧化物歧化酶），对肠黏膜OS损伤有良好的修复作用。口腔是消化道的起点，表达于口腔角质形成细胞中的VDR与维生素D特异性结合也可以通过降低OS水平和清除ROS，修复受损的口腔黏膜上皮屏障，促进病损愈合[58-59]。1,25(OH)2D3-VDR信号通路在维持口腔黏膜组织完整性中具有保护性作用，由此推测补充维生素D可能是治疗OLP病损的一种潜在策略。
3 小结
综上所述，OPMD与OS之间存在密切联系。微量营养素主要以直接抗氧化剂（如维生素A、C和E）或作为抗氧化酶的组成部分（如Cu、Zn、Se）发挥抗氧化作用。微量营养素水平的改变可以通过调控相关转录因子及其信号通路参与机体炎症和OS反应。
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