摘 要：口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)是一种慢性、进行性、与咀嚼槟榔有关的口腔黏膜疾病，主要表现为口腔黏膜苍白、进食刺激性食物时口腔黏膜烧灼疼痛、张口受限、软腭区水疱等。OSF具有恶变倾向，其恶变率为7%～13%。因此，WHO将其列入口腔潜在恶性疾患的范畴。OSF的恶变机制尚未完全清楚，目前多认为是多因素共同作用的结果，包括遗传易感性、细胞周期改变、上皮相关蛋白改变、缺氧、血管生成、细胞衰老、上皮-间充质转化等。本文对OSF恶变机制进行归纳总结，旨在为了解该病恶变规律及临床早期防治提供参考。
关键词：口腔黏膜下纤维性变 恶变 机制
Mechanisms of Malignant Transformation of Oral Submucous Fibrosis: An Update
ZHU Jiayi LU Rui
The State Key Laboratory Breeding Base of Basic Science of Stomatology (Hubei-MOST)& Key Laboratory of Oral Biomedicine Ministry of Education,School & Hospital of Stomatology,Wuhan University; Department of Oral Medicine,School & Hospital of Stomatology,Wuhan University;
Abstract：Oral submucous fibrosis(OSF) is a chronic and progressive oral mucosal disease associated with betel nut chewing. The main manifestations include pale oral mucosa, burning sensation in oral cavity when eating spicy food, progressive limitation of mouth opening, and blisters in soft palate. OSF contains a malignant potential, with the malignant transformation rate ranging from 7% to 13%. As a result, it was included into the classification of oral potentially malignant disorders by the WHO. The mechanisms of malignant transformation of OSF comprise of various aspects, including genetic susceptibility, cell cycle changes, epithelial-related protein changes, hypoxia, angiogenesis, senescence, epithelial-mesenchymal transition, etc., which have not been fully revealed. In this review, we summarize the molecular mechanisms of the malignant transformation of OSF, aiming to provide references for understanding the mechanisms and early prevention of OSF malignant transformation.
Keyword：oral submucous fibrosis; malignant transformation; mechanisms;
口腔黏膜下纤维性变(oral submucous fibrosis, OSF)是一种慢性、进行性、具有恶变倾向的口腔黏膜疾病，临床上表现为口腔黏膜苍白、进食辛辣食物时黏膜烧灼疼痛、张口受限、软腭区水疱等，主要病理变化包括黏膜上皮组织萎缩，固有层及黏膜下层胶原纤维堆积、变性和血管闭塞、减少[1]。OSF多见于东南亚国家与地区，我国主要见于湖南、台湾、海南等地区[1]。流行病学研究显示，咀嚼槟榔是导致OSF最主要的因素，咀嚼槟榔者患OSF的相对危险值为不嚼槟榔者的109～287倍，且每日嚼槟榔的频率越高、嚼食年限越长，患OSF的几率越大[1]。
OSF具有恶变倾向，流行病学资料显示，其恶变率为7%～13%。因此，WHO将其列入口腔潜在恶性疾患的范畴[1,2]。该病恶变机制尚未完全清楚，目前认为是多因素共同作用的结果。本文对OSF恶变机制归纳总结，旨在为了解该病恶变规律及临床早期防治提供参考。
1 OSF恶变机制
1.1 遗传易感性
遗传易感性是指由基因基础决定的个体患病风险，包括基因的杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)、基因突变、基因异质性、单核苷酸多态性等。Teh等[3]发现，超过50%的OSF患者存在离散的热点LOH位点，其程度与OSF病情严重程度呈正相关，同时这些LOH位点多位于已知的头颈癌相关基因组不稳定区，提示可能与OSF恶变有关。另有研究指出，在OSF和口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)共同的LOH区域(如13q14-q33、3p24-p22、6q26-q27、9q22.3、12p11.2及20p12-11等)中包含许多抑癌基因，如PTEN、乳腺癌基因1/2(breast cancer 1/2,BKCA1/2)、脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad, FHIT)、loricin、细胞色素P450(cytochromep450,CYP450)等，在DNA修复、缺氧、细胞粘附等过程中发挥重要的调节功能，一旦这些抑癌基因发生LOH,其表达和功能将受到影响，使恶变率增加[2,4]。
1.2 细胞周期改变
细胞周期与有丝分裂受到多种周期蛋白的精准调控，这些调控蛋白的异常表达可引起细胞周期紊乱，同时可使DNA受损的细胞通过细胞周期检查点，导致遗传不稳定因素积累，促进肿瘤的发生发展[5]。研究发现，在OSF及其恶变组织中存在着多种细胞周期调控蛋白及其相关蛋白的异常表达。Zhou等[5]发现，G2/M期细胞周期蛋白B1(Cyclin B1)和细胞分裂周期蛋白2(cell division cycle 2,p34cdc2)表达水平在正常口腔黏膜、OSF早、中、晚期和OSF恶变组织中逐渐增强，同时p34cdc2的水平增高可使凋亡抑制因子Survivin磷酸化。研究发现，磷酸化Survivin在OSF上皮组织中出现异常表达，且随着OSF恶变进程逐渐增强，可能通过抑制细胞凋亡导致细胞异常增殖，促进恶变发生[5]。鉴于磷酸化Survivin的表达水平与OSF恶变过程密切相关，有学者认为其可能成为潜在的生物标志物和治疗靶标用于OSF恶变的早期诊断与干预[6]。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)是一种与细胞周期有关的核蛋白，PCNA指数反映了细胞增殖状态，其异常表达与疾病的恶变潜能相关[7]。研究发现，OSF上皮中PCNA的表达水平显著高于正常口腔黏膜，且随着病情严重程度的增加逐渐增高[7,8]。PCNA在OSF上皮中的表达多集中在基底层与棘层，表层表达相对较少，而在OSCC上皮全层中均可见其表达[7]。提示细胞周期改变可能与OSF恶变过程有关[8]。
体外研究发现，槟榔碱能减少OSCC细胞中细胞周期抑制子p21和p27的表达水平，促进G1/S期转换，增加DNA复制错误的风险[9]。另外，槟榔碱可诱导上皮细胞中Cyclin B1、磷酸化p34cdc2以及Wee1等细胞周期调控蛋白的异常表达[10]。这些研究从细胞水平验证了槟榔碱诱导的细胞周期改变可能是OSF恶变机制之一。
1.3 上皮相关蛋白改变
研究发现，相较于正常口腔黏膜，OSF上皮有其独特的角蛋白表达模式，表现为泛角蛋白、高分子量角蛋白表达增强，细胞角蛋白5(cytokeratin5,CK5)、CK14表达降低[11]。同时，在正常口腔黏膜中不表达的CK8,在OSF与OSCC组织中出现异常表达，提示其与OSF恶变可能关联[11]。Lalli等[12]发现，在OSF基底上层出现角蛋白K1、K10和K17的表达升高，在基底层出现K6的异常表达，而K19则在上皮层中完全缺失。有人推测，这些角蛋白表型改变反映了OSF上皮基因功能变化，评估这些角蛋白表型改变可为OSF的发生和恶变机制提供线索[13]。
整合素是一类跨膜受体，具有调节细胞周期、细胞形态与细胞能动性等功能，其异常表达可促进组织纤维化和细胞侵袭功能，与多种恶性肿瘤的发生有关[14]。Moutasim等[15]发现，OSF角质形成细胞中αυβ6整合素的表达水平显著增高，而在OSF恶变组织中，有80%出现αυβ6整合素的中至高表达。同时发现，槟榔碱可增加口腔角质形成细胞中αυβ6整合素的表达，从而促进细胞迁移和侵袭[15]。提示槟榔碱或可通过诱导整合素高表达，改变角质形成细胞的生物学功能，促进了OSF恶变进程。
1.4 缺氧
组织缺氧与肿瘤发生发展关系密切。缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-alpha, HIF-1α)为缺氧诱导的关键调控因子，可介导多种基因的活化表达，涉及血管生成、无氧酵解、去粘附和细胞侵袭等病理过程，与肿瘤发生关系密切[16]。研究发现，OSF组织中HIF-1α的mRNA和蛋白质水平均高于正常黏膜，且与上皮异常增生程度呈正相关，同时槟榔碱可促进颊黏膜来源的成纤维细胞高表达HIF-1α[17-19]。碳酸酐酶Ⅸ(carbonic anhydrase Ⅸ ,CAⅨ)是HIF-1α的直接靶蛋白，参与胞内pH调控，帮助产生和维持适宜肿瘤细胞生长的pH环境，在多种肿瘤细胞中过度表达[20]。研究发现，OSF病损组织的成纤维细胞中CAⅨ的mRNA水平显著高于正常成纤维细胞，且槟榔碱可以提高成纤维细胞中CAⅨ的表达水平，有咀嚼槟榔习惯的口腔癌患者，其血清中CAⅨ水平显著高于无咀嚼槟榔习惯的患者[21]。上述研究提示OSF组织缺氧及其诱导的关键蛋白表达，可能是槟榔导致OSF恶变的环节之一。
1.5 血管生成
传统观点认为，OSF基本病理变化为组织过度纤维化伴血管减少，导致上皮发生缺血性萎缩，使其更易遭受致癌物的侵袭[2]。然而近年研究发现，与正常组织相比，OSF局部平均血管密度(mean vascular density, MVD)反有升高倾向，且OSF组织中平均血管管腔直径显著高于正常黏膜，对传统观点提出了挑战[22,23]。对不同时期OSF的局部血管形态进行动态观察发现，OSF早期局部血管密度增加，进展期减少，而在恶变过程中又呈现逐渐增加的趋势[24]。由此可见，在OSF发展至恶变过程中，局部的血管生成可能具有一定的时序性：在疾病早期，槟榔造成的炎症反应发挥主要作用，刺激血管生成；随着纤维化的进展及槟榔碱毒性作用的累积，血管生成逐渐减少，导致病损上皮出现缺血性萎缩，更易受到致癌物质的侵袭；而在OSF发生恶变的过程中，由于局部微环境的刺激作用，血管分布重新增加，并对恶变进程发挥重要的支持作用[25]。
分子机制研究发现，多种内源性血管生成促进因子，如HIF-1α、VEGF、iNOS、TGF-β、TNF-α、b-FGF等在OSF病损局部均表达升高[26]。另外，槟榔中的铜元素可促进HIF-1α与VEGF基因上的低氧反应元件结合，形成HIF-1转录复合体，可提高VEGF表达，促进血管生成[27]。因此可推测，咀嚼槟榔和OSF病损微环境共同诱导血管生成促进因子的异常表达，可能在局部血管生成变化中发挥调控作用。
1.6 细胞衰老
细胞衰老是指细胞的增殖能力和生理功能随着时间的推移逐渐衰退的现象。研究表明，衰老的细胞可产生衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP),包括炎性细胞因子、生长因子、趋化因子和基质金属蛋白酶等，这些因子可反作用于衰老细胞及邻近细胞，加速细胞衰老，并可使组织微环境产生慢性炎症、组织损伤及恶性转化[28]。
Pitiyage等[29]研究发现，随着OSF的进展，病损局部逐渐出现衰老成纤维细胞的积累，与氧化损伤、DNA损伤位点及p16INK4A的积累显著相关，且发现该过程是由线粒体功能失调产生活性氧物质(reactive oxygen species, ROS)而非槟榔或烟草刺激直接介导，提示OSF相关成纤维细胞衰老可能与内源性因素有关。进一步研究显示，SASP相关细胞因子GRO-α、IL-6、IL-8等在OSF病损局部表达增高，且槟榔提取物可显著增加成纤维细胞分泌上述细胞因子的水平[30]。值得注意的是，这些SASP相关细胞因子的刺激作用反之可提高口腔角质形成细胞中产生ROS的细胞、DNA损伤结合蛋白(DNA damaged -binding protein, DDB)阳性细胞和异倍体细胞的比例，这些变化均与组织恶变有关[30]。因此槟榔与内源性因素的双重作用可能使OSF局部成纤维细胞发生衰老并产生SASP,对邻近组织微环境造成炎性损伤，从而在OSF发展及恶变过程中发挥促进作用。
1.7 上皮间充质转化
上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指上皮细胞通过特定作用机制转化为间充质表型细胞的生物学过程[31]。发生EMT的上皮细胞逐渐丧失细胞极性及与基底膜连接等上皮表型，同时获得较强的迁移、侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质等间充质表型，在胚胎发育、慢性炎症、组织纤维化、肿瘤发生等过程中均发挥了重要作用。在OSF的上皮细胞中，EMT的表型显著增强。Das等[32]观察到，与不伴上皮异常增生的病例相比，伴上皮异常增生的OSF上皮细胞中E-cadherin及β-catenin表达减少，N-cadherin、TWIST1表达增加，符合EMT的表达规律。Zheng等[33,34]通过体外实验发现，槟榔碱可抑制角质形成细胞中CK19和E-cadherin表达，促进波形蛋白和N-cadherin表达，从而诱导上皮发生EMT,而miR-203和丹参酮可对此诱导过程产生抑制和阻碍作用。上述研究提示槟榔促使口腔上皮细胞发生EMT可能是OSF形成和恶变过程中的重要环节，同时亦有可能成为潜在的阻断OSF恶变发展的治疗靶标。
1.8 其他
除了上述机制以外，近年来学者们还从肿瘤干细胞[35]、表观遗传调控[36]、微量元素[37]、口腔微生物组[38]等多个角度对OSF恶变机制进行了新的阐述，同时对找寻和建立OSF恶变生物标记物和治疗靶标[39]进行了相应探索，这些新近的研究工作将有助于拓宽人们对OSF恶变机制的认识理解，并对其恶变防治提供新的参考和思路。
2 结语
综上所述，OSF恶变机制错综复杂，涉及遗传易感性、细胞周期、上皮相关蛋白改变、缺氧、血管生成、细胞衰老、上皮间充质转化，以及一些新发现的机制等。各机制之间相互关联，彼此影响，共同促进了OSF恶变进程的发展。随着OSF及其恶变相关疾病负担的日益加重，除了加强对咀嚼槟榔的危害性进行宣传之外，对OSF发生发展及其恶变机制仍需继续探索，为明确疾病发生及恶变规律、找寻新的治疗靶标及防治策略提供线索。
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