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口腔科学论文

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成纤维细胞生长因子受体4基因沉默对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制

来源:搜集整理   日期:2021-08-31 10:30:22点击数:

  摘    要:目的 :探讨成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)基因沉默介导RAS/RAF/MAPK信号通路对口腔鳞癌细胞增殖和凋亡的影响。方法 :收集本院2018年4月至2019年8月收治的口腔鳞癌患者32对肿瘤组织样本和癌旁非癌组织,利用免疫组织化学和免疫印迹检测FGFR4蛋白的表达;免疫印迹检测正常口腔上皮细胞HOEC和口腔鳞癌细胞(HSC-2、CAL-27和SACC-83)中FGFR4蛋白的表达水平。通过基因沉默技术下调FGFR4表达,利用qRT-RCR和免疫印迹检测SACC-83细胞的FGFR4表达的变化,克隆形成实验检测SACC-83细胞的增殖能力,流式细胞术检测SACC-83细胞的凋亡和细胞周期,免疫印迹检测SACC-83细胞的RAS/RAF/MAPK信号通路。结果 :与癌旁非癌组织相比,口腔鳞癌组织的FGFR4表达升高;与正常口腔上皮细胞HOEC相比,口腔鳞癌细胞(HSC-2、CAL-27和SACC-83)的FGFR4表达量高;下调FGFR4表达可抑制SACC-83细胞的增殖,抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,上调凋亡蛋白Bax的表达,促进SACC-83细胞的凋亡,同时抑制周期蛋白P21的表达,使SACC-83细胞停滞于G0/G1期;下调FGFR4表达可抑制RAS、RAF及p-MEK和p-ERK1蛋白的表达。结论 :下调FGFR4表达可抑制口腔鳞癌细胞增殖,促进细胞凋亡,使其停滞于G0/G1期,可能与抑制RAS/RAF/MAPK信号通路有关。
  
  关键词:口腔鳞癌 成纤维细胞生长因子受体4 RAS/RAF/MAPK信号通路 细胞增殖 细胞凋亡
  
  Effects of FGFR4 gene silencing on proliferation and apoptosis of oral squamous cell carcinoma cells and their mechanism
  
  Dong Qingxu Zhao Zhengli
  
  Department of Stomatology, Affiliated Hospital of Henan Medical College;
  
  Abstract:Objective : To investigate the effects of FGFR4 gene silencing-mediated RAS/RAF/MAPK signaling pathway on proliferation and apoptosis of oral squamous carcinoma cells. Methods : Thirty-two pairs of tumor tissue samples and paracancerous noncancerous tissues were collected from oral squamous cell carcinoma patients admitted to the Affiliated Hospital of Henan Medical College from April 2018 to August 2019. Oral squamous cell carcinoma tissues and adjacent non-cancerous tissues were obtained to detect the expression of FGFR4 by using immunohistochemistry and Western blotting. Western blotting was used to detect the expression of FGFR4 in normal oral epithelial cells HOEC and oral squamous carcinoma cells(HSC-2, CAL-27 and SACC-83). Down-regulation of FGFR4 was performed by gene silencing technology, and then qRT-PCR and Western blotting were used to detect FGFR4 expression in SACC-83 cells, colony formation assay was used to measure proliferation of SACC-83 cells, flow cytometry was utilized to evaluate apoptosis and cell cycle of SACC-83 cells, Western blotting was used to detect the expression of RAS, RAF, p-MEK and p-ERK1 in SACC-83 cells. Results : Compared with adjacent non-cancerous tissues, FGFR4 expression was increased in oral squamous carcinoma tissues; Compared with the normal oral epithelial cell HOEC, FGFR4 was over-expressed in oral squamous carcinoma cells(HSC-2,CAL-27 and SACC-83);Down-regulation of FGFR4 inhibited proliferation of SACC-83 cells and the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2, promoted the expression of apoptotic protein Bax and apoptosis of SACC-83 cells. Moreover, silencing FGFR4 inhibited the expression of cyclin P21, and resulted in a higher proportion of SACC-83 cells in G0/G1 phase. Down-regulation of FGFR4 could inhibit the protein level of RAS, RAF, p-MEK and p-ERK1. Conclusion : Down-regulation of FGFR4 can inhibit proliferation of oral squamous carcinoma cells, and promote apoptosis and make them stagnate in G0/G1 phase, which may be related to the inhibition of RAS/RAF/MAPK signaling pathway.
  
  Keyword:oral squamous cell carcinoma; fibroblast growth factor receptor 4; RAS/RAF/MAPK signaling pathway; cell proliferation; apoptosis;
  
  口腔鳞癌约占所有口腔癌的90%[1],多种基因突变的积累会导致口腔上皮细胞发展为癌症[2],患者5年生存率低于50%[3]。因此,研究口腔鳞癌的发生发展机制非常重要。研究证实,成纤维细胞生长因子受体4(fibroblast growth factor receptor 4,FGFR4)在胚胎发育、血管生成中起关键作用[4]。FGFR4在肿瘤中的高表达[5]、多态性与肝癌的转移相关[6]。RAS/RAF/MAPK通路能够在细胞核中激活特定的基因促进细胞生长和分化[7],参与肿瘤细胞增殖和凋亡[8]。RAS是突变最频繁的致癌基因,40%食管癌患者具有RAS扩增的特点[9],大约50%的乳腺癌与RAS的高表达密切相关[10]。RAF进一步促使MAPK磷酸化信号级联激活,诱导特定基因转录[8]。蛋白激酶MAPK是RAS/RAF/MAPK通路的核心成分,在细胞增殖、分化等程序中发挥重要作用[11]。阐明RAS/RAF/MAPK通路的调控机制有助于明确肿瘤的发展机制。FGFR4过表达可活化GRB2和SOS蛋白,进而激活RAS/RAF/MAPK通路[12]。因此本研究探究下调FGFR4基因的表达与RAS/RAF/MAPK信号通路的调节作用及对口腔鳞癌增殖和凋亡的影响。
  
  1 材料和方法
  
  1.1 组织样本、细胞株及主要试剂
  
  收集本院于2018年4月至2019年8月收治的口腔鳞癌患者的32对肿瘤组织样本和癌旁非癌组织。所有患者术后病理诊断为口腔鳞癌,术前未行化疗或放疗,具有完整病史记录,且所有患者已签署知情同意书。组织样本均保存于-80℃,使用时同时处理肿瘤组织及非肿瘤样本组织。人正常口腔上皮细胞HOEC购自上海弘顺生物科技有限公司;人口腔鳞癌细胞CAL-27和HSC-2均购自上海酶研生物科技有限公司;SACC-83细胞购自江阴雨汐生物科技有限公司。胎牛血清、胰蛋白酶、RPMI-1640培养基、MEM培养基和DMEM培养基、q RT-PCR试剂盒、细胞凋亡检测试剂盒购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司;TRIzol试剂购自上海联迈生物工程有限公司;Bcl-2、Bax、RAS、RAF、MEK、p-MEK、ERK1、p-ERK1和FGFR4抗体购自Abcam公司;二抗(羊抗兔)购自美国CST公司;显影液和定影液购自碧云天生物科技有限公司;细胞周期检测试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司。
  
  1.2 细胞培养
  
  人正常口腔上皮细胞HOEC用RPMI-1640(15%胎牛血清)培养基在37℃、5%CO2的条件下于培养箱中培养;SACC-83细胞用MEM(15%胎牛血清)培养基在37℃、5%CO2的条件下于培养箱中培养;CAL-27细胞和HSC-2细胞用DMEM(10%胎牛血清)在37℃、5%CO2的条件下于培养箱中培养。
  
  1.3 细胞转染
  
  收集对数生长期SACC-83细胞,以每孔3.5×106个细胞接种于6孔板内过夜培养。细胞分为3组:空白组、si NC组和si FGFR4组。空白组细胞不作任何处理,si NC组和si FGFR4组细胞中分别将20 ng的si NC和si FGFR4质粒分别与15μL的LipofectamineTM 2000混合,加入孔内,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中。转染24 h后,收集细胞。
  
  1.4 q RT-PCR检测FGFR4 m RNA表达水平
  
  利用TRIzol试剂提取细胞的RNA,RNA样品中加入100μL氯仿充分混匀后,4℃12 000r/min离心15 min,上层液体中加入新无RNA酶离心管,加入等体积异丙醇,混匀后-20℃静置10 min,离心10 min,弃上清,加入无水乙醇清洗沉淀,重复清洗1次,弃上清,加入20μL RNase-free水溶解RNA。反转录根据q RT-PCR试剂盒说明进行。将逆转录产物进行q RT-PCR检测,反应体系为:c DNA模板2 ng,上下游引物各0.4μL,SYBR Primix Ex TaqTM 5μL,dd H2O补充至10μL。扩增结果根据2-△△Ct法计算FGFR4m RNA的相对表达量。FGFR4上游引物序列为5'-TCCTACCTGAGGATGCTGGCCGCT-3',下游引物序列为5'-ACCGTCGGCTCCGAAGCTGCTGC CGA-3';β-actin上游引物序列为5'-CCGTTGCCC TGAGGCTCTTT-3',下游引物序列为5'-GATCTG TCTGTCTTCTGTCTC-3'。
  
  1.5 免疫印迹检测FGFR4、Bcl-2、Bax、RAS、p-MEK和p-ERK1蛋白表达水平
  
  将RIPA裂解液加入细胞中裂解蛋白,利用BCA法检测细胞蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳分离等量蛋白后转膜。利用5%脱脂牛奶4℃封闭1 h,加鼠抗人的Bcl-2、Bax、RAS、RAF、MEK、p-MEK、ERK1、p-ERK1抗体(1∶2 000)和FGFR4抗体摇床4℃孵育过夜,TBST洗膜5 min,4次,加入HRP标记的兔抗鼠二抗(1∶1 500)37℃孵育1 h,TBST洗膜5 min,4次。显影曝光后,通过ImagePro Plus系统分析蛋白条带灰度值,计算(目的蛋白/β-actin)的比值。
  
  1.6 免疫组织化学检测FGFR4的表达
  
  将获得的肿瘤组织样本和癌旁非肿瘤组织进行常规石蜡切片,切片脱蜡后蒸馏水浸洗1 min后,对切片进行抗原修复,滴加3%的过氧化氢于切片组织上,室温孵育10 min,PBS冲洗5次,每次2 min。滴加稀释好的山羊血清,孵育40 min,去除玻片周围液体,滴加鼠抗人FGFR4抗体,置于4℃孵育过夜。PBS冲洗切片5次,每次2 min,去除玻片周围液体,滴加二抗37℃孵育25 min。PBS冲洗切片,滴加DAB显色液,自来水冲洗终止染色后,Harris苏木精复染45 s,水洗后用1%的盐酸乙醇分化,再用自来水水洗返蓝。将切片置于无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ脱水后,平置于通风橱晾干,镜检拍照。
  
  1.7 克隆形成实验检测SACC-83细胞的增殖
  
  胰蛋白酶消化对数生长期细胞,完全培养基重悬细胞后计数。以每孔800个细胞接种于6孔板内,置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养,每3 d更换培养基并观察细胞,在6孔板底部对单克隆细胞标记。培养8 d后观察细胞,弃上清,PBS洗涤细胞,加入1 m L 4%多聚甲醛,4℃固定细胞1 h,PBS洗涤细胞,加入1 000μL结晶紫染色液作用细胞2 min,dd H2O洗涤细胞,选取肿瘤丰富的区域,置于200×高倍镜,胞质或细胞核染成棕黄色表示为阳性细胞,200×镜下计数400个肿瘤细胞中阳性细胞数,统计数值:阳性细胞数/肿瘤细胞数×100%,重复5次后取平均值。
  
  1.8 流式细胞术检测SACC-83细胞凋亡和细胞周期
  
  将转染si RNA 24 h的SACC-83细胞胰蛋白酶消化,离心收集细胞后利用冰预冷的PBS洗涤细胞。在避光条件下,加入FITC-Annexin V和碘化丙钠(PI),静置15 min后,加入Binding Buffer混匀置于冰上,利用流式细胞仪检测细胞凋亡。收集人口腔鳞癌细胞SACC-83,调整细胞数目为106/m L,加入70%乙醇固定细胞,PBS洗涤细胞后,离心去除上清,加入RNase 37℃孵育30 min,加入碘化丙啶(PI),孵育15 min,利用流式细胞仪分析细胞周期。
  
  1.9 统计学处理
  
  采用SPSS 20.0软件进行分析,符合正态分布的数据采用±s表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异具有统计学意义。
  
  2 结果
  
  2.1 FGFR4在口腔鳞癌组织及口腔鳞癌细胞中的表达
  
  32对样本的免疫组织化学显色结果显示,FGFR4在正常口腔上皮组织中表达微弱,但在口腔鳞癌组织中过度表达(图1A)。与免疫组织化学染色结果一致,免疫印迹检测显示,肿瘤组织中的FGFR4蛋白水平高于相应的非癌组织(图1B)。此外,与正常口腔上皮细胞HOEC相比,在口腔鳞癌细胞系(HSC-2、CAL-27和SACC-83)中检测到不同程度的FGFR4过表达(P<0.01)(图1C、D)。SACC-83细胞系中的FGFR4蛋白表达水平较高,可作为以下研究基础。
  
  2.2 沉默FGFR4基因对口腔鳞癌细胞增殖的影响
  
  为了研究FGFR4对口腔鳞癌细胞增殖的影响,将FGFR4 si RNA转染SACC-83细胞24 h后进行q RT-PCR、免疫印迹和克隆形成实验。q RT-PCR实验结果显示,与si NC组(0.987±0.061)相比,siFGFR4组(0.305±0.015)的FGFR4 m RNA相对表达量显著降低(P<0.01)(图2A);免疫印迹检测结果显示,si-FGFR4组的FGFR4蛋白表达水平明显低于si NC组,说明si RNA可以有效抑制FGFR4的表达(图2B)。克隆形成实验检测沉默FGFR4基因对SACC-83细胞增殖的影响,结果显示,与si NC组相比,si-FGFR4组细胞克隆数减少约40.6%(P<0.01)(图2C、D)。
  
  2.3 沉默FGFR4基因对口腔鳞癌细胞凋亡的影响
  
  为了研究FGFR4对口腔鳞癌细胞凋亡的影响,对已转染FGFR4 si RNA的SACC-83细胞进行流式细胞术检测。流式细胞术检测结果显示,与si NC组相比,si-FGFR4组细胞凋亡数目增加(P<0.01)(图3A、B)。免疫印迹检测结果显示,与si NC组相比[Bcl-2表达量为(0.812±0.120),Bax表达量为(0.469±0.060)],沉默FGFR4抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2的表达(0.378±0.080)(P<0.01),上调凋亡蛋白Bax的表达(0.885±0.090)(P<0.01)(图3C、D)。
  
  2.4 沉默FGFR4基因对口腔鳞癌细胞周期的影响
  
  为了研究FGFR4基因对口腔鳞癌细胞周期的影响,对已转染FGFR4 si RNA的SACC-83细胞进行流式细胞术检测。实验结果显示,与si NC组相比,转染si FGFR4使SACC-83细胞在G0/G1期停滞(图4A)。免疫印迹检测结果显示,沉默FGFR4抑制周期蛋白P21的表达(P<0.05)(图4B)。
  
  2.5 沉默FGFR4基因抑制RAS/RAF/MAPK信号通路
  
  为了研究沉默FGFR4对RAS/RAF/MAPK信号通路的影响,将收集的已转染FGFR4 si RNA的SACC-83细胞进行免疫印迹检测。结果显示,si NC组的EGFR表达量为(0.732±0.210)、RAS为(0.634±0.080)、RAF为(0.601±0.680)、p-MEK/MEK为(0.768±0.410)、p-ERK1/ERK1为(0.753±0.540);si-FGFR4组的EGFR(0.197±0.280),RAS表达量为(0.317±0.720)、RAF为(0.309±0.620)、p-MEK/MEK为(0.409±0.320)和p-ERK1/ERK1为(0.325±0.080);较si NC组显著降低(P<0.05),说明沉默FGFR4基因可抑制RAS/RAF/MAPK信号通路(图5A、B)。
  
  图1 FGFR4在口腔鳞癌组织和口腔鳞癌细胞系中的表达,标尺=100μm。A:免疫组织化学检测FGFR4的表达;B、C:免疫印迹检测FGFR4的表达;D:FGFR4/β-actin比值,**P<0.01 vs HOEC.
  
  图2 沉默FGFR4对口腔鳞癌细胞SACC-83增殖的影响。A、B:SACC-83细胞分别瞬时转染NC siRNA和FGFR4 siRNA,提取总RNA和细胞溶解产物在转染后2 4 h内,用qRT-PCR和免疫印迹检测FGFR4在mRNA和蛋白水平的表达(**P<0.01 vs siNC);C、D:克隆形成实验检测FGFR4沉默后SACC-83细胞增殖能力,**P<0.01 vs siNC.
  
  图3 沉默FGFR4对口腔鳞癌细胞SACC-83的凋亡影响。A、B:流式细胞术检测FGFR4对SACC-83细胞凋亡的影响(**P<0.01 vs siNC);C、D:免疫印迹检测抗凋亡蛋白Bcl-2和凋亡相关蛋白Bax蛋白的表达(**P<0.01 vs siNC).
  
  图4 沉默FGFR4对口腔鳞癌细胞周期的影响
  
  A:流式细胞术检测FGFR4对SACC-83细胞周期的影响(与siNC相比);B:免疫印迹检测细胞周期蛋白P21蛋白的相对表达量(*P<0.05 vs siNC)
  
  3 讨论
  
  口腔鳞癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,发病率约占头颈部鳞状细胞癌的40%[13]。与其他恶性肿瘤相比,口腔鳞癌的生存指数低、预后复发和转移概率较高[14]。根据世界卫生组织数据显示,每年口腔鳞癌的死亡人数高达14.5万[15]。尽管在预防和治疗方面已取得相应进展,但口腔鳞癌诊断的延误仍然是高发病率和高死亡率的主要原因之一[16]。因而,探究抑制口腔鳞癌细胞增殖和迁移的分子机制,是解决当前临床口腔鳞癌防治的关键之一。
  
  FGFR4是高度保守的酪氨酸激酶受体家族成员之一,由一个细胞配体结构域、单跨膜螺旋结构域和具有酪氨酸激酶活性的细胞质结构域组成[17]。在癌症中,FGFR4基因异常会影响FGFR4蛋白的下游信号通路,导致持续的细胞增殖,促进肿瘤的发生发展[18]。研究表明,FGFR4是肝细胞癌的驱动因素[19],FGFR4可增加肺腺癌中表皮生长因子受体(EGFR)的致癌信号,阻断FGFR4可显著抑制ESCC的恶性行为[20]。此外,FGFR4在乳腺癌细胞中过表达,是引起肿瘤细胞恶性生物学行为的原因[21]。这些研究表明,FGFR4可能是一个促癌因子。Choi等[22]报道FGFR4单核苷酸多态性可作为预测口腔鳞癌淋巴结转移的因素;Chia-Hsuan等[23]报道FGFR4的多态性与口腔鳞癌的易感性相关。这说明FGFR4可能与口腔鳞癌的发生发展相关。然而,目前FGFR4与口腔鳞癌发生发展的相关分子机制的研究报道甚少。本研究结果显示,FGFR4在口腔鳞癌组织样本和细胞系中显著高表达,暗示FGFR4的高表达与口腔鳞癌细胞的发生发展过程相关。研究显示下调FGFR4表达,会抑制口腔鳞癌细胞SACC-83的增殖,降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进凋亡相关蛋白Bax的表达,细胞凋亡的数目增加;此外,P21蛋白表达降低。P21是调控细胞周期的主要蛋白,通过与增殖细胞核抗原结合,抑制DNA聚合酶复合物的形成,进而影响细胞复制,阻滞细胞周期,特别是G0/G1期[24]。本研究证实,下调FGFR4表达,使SACC-83细胞停滞于G0/G1期。这说明在口腔鳞癌细胞SACC-83中,下调FGFR4表达具有抑制其细胞增殖,促进细胞凋亡的作用。本研究结果表明,FGFR4在口腔鳞癌细胞SACC-83中发挥的功能与其在乳腺癌、肝癌、肺腺癌等癌症中的生物学功能一致,具有明显的促癌作用。
  
  图5 沉默FGFR4对RAS/RAF/MAPK信号通路影响免疫印迹检测EGFR、RAS、RAF、p-MEK、MEK、p-ERK1和ERK1蛋白的表达,*P<0.05 vs si NC
  
  研究表明,肿瘤细胞中过表达的FGFR4和Klotho蛋白结合,与FGFR19组成同源二聚体复合物,随后激活RAS/RAF/MAPK信号通路,最终导致肿瘤细胞的增殖和迁移[25]。已有研究显示,RAS/RAF/MAPK信号通路与乳腺癌和直肠癌的发生发展相关[26-27]。白玥等[28]报道甲氨蝶呤通过RAS/MAPK信号通路抑制胶质母细胞瘤的生长;候晓洁等[29]报道华蟾毒配基联合索拉非尼通过AURKA/RAS/RAF/ERK信号通路影响肝癌Huh7细胞增殖与凋亡。这些研究表明,RAS/RAF/MAPK信号通路参与肿瘤发生发展和恶性转化过程。本研究结果显示,在口腔鳞癌细胞中下调FGFR4,降低RAS、p-RAF和p-ERK1/2蛋白的表达,提示下调FGFR4的表达抑制口腔鳞癌中RAS/RAF/MAPK信号通路的活化。之前的研究显示,RAS/RAF/MAPK在胶质母细胞瘤、肝癌、乳腺癌和直肠癌发展过程中被异常激活,而本研究的实验结果提示,在口腔鳞癌细胞SACC-83中RAS/RAF/MAPK通路同样被激活,也可能参与了癌细胞的发展,进一步表明抑制该通路活化有可能成为癌细胞靶向治疗的关键。
  
  综上所述,FGFR4在口腔鳞癌组织和口腔鳞癌细胞中高表达,下调FGFR4可抑制RAS/RAF/MAPK信号通路的激活,进而抑制口腔鳞癌细胞增殖,使细胞周期停滞于G0/G1期,促进其凋亡。以上结果初步明确FGFR4在口腔鳞癌进展中发挥重要作用,为进一步探索口腔鳞癌的发生发展机制提供新的思路。
  
  参考文献
  
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