关键词：
神经纤维瘤病 骨内神经纤维瘤 下颌骨 S-100
摘 要：
目的:研究过表达SOX2通过PI3K/AKT通路促进口腔鳞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)细胞迁移及上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)的作用及机制。方法:收集OSCC组织及正常口腔黏膜组织,培养OSCC细胞株Tca83、SCC25、HN4与正常口腔上皮细胞株FM,检测SOX2的mRNA表达水平。Tca83细胞随机分为转染阴性对照(NC)质粒的NC组、转染SOX2质粒的SOX2组、转染NC质粒并加用安慰剂的安慰剂+NC质粒组、转染SOX2质粒并加用安慰剂的安慰剂+SOX2质粒组、转染SOX2质粒并加用PI3K抑制剂LY294002的LY294002+SOX2组,检测细胞迁移、EMT标志基因波形蛋白(Vimentin)及E-钙黏蛋白(E-cadherin)、p-PI3K、p-AKT的表达量。结果:OSCC组织中SOX2的mRNA表达水平高于正常口腔黏膜组织,Tca83、SCC25、HN4细胞中SOX2的mRNA表达水平高于FM细胞且Tca83细胞中SOX2表达增加幅度最弱。与NC组比较,SOX2组Tca83细胞的迁移增强,Vimentin、p-PI3K、p-AKT的表达增加,E-cadherin的表达减少。与安慰剂+SOX2组比较,LY294002+SOX2组Tca83细胞的迁移减弱,Vimentin、p-PI3K、p-AKT的表达减少,E-cadherin的表达增加。结论:OSCC中SOX2表达增加,过表达通过激活PI3K/AKT通路促进OSCC细胞迁移及EMT。
关键词：
口腔鳞癌 SOX2 迁移 上皮间质转化 PI3K/AKT通路
Mechanism of overexpression of SOX2 in regulating migration and EMT of oral squamous cell carcinoma cells through PI3K/AKT pathway
CHEN Chang-sheng WU Yu-nong WANG Qi WANG Chang-lin SHI Zhen-yi
Department of oral and maxillofacial surgery,Stomatological College of Nanjing Medical University; Department of oral and maxillofacial surgery,Stomatological Hospital of Jiangsu; Department Of Pathology,Yancheng Third People's Hospital; Department Of Stomatology,Yancheng Third People's Hospital;
Abstract：
Objective:To investigate the effect and mechanism of overexpression of SOX2 on the migration and epithelial mesenchymal transition(EMT)of oral squamous cell carcinoma(OSCC)cells through PI3 K/AKT pathway.Methods:OSCC tissues and normal oral mucosa tissues were collected,OSCC cell lines Tca83,SCC25,HN4 and normal oral epithelial cell line FM were cultured,and the mRNA expression level of SOX2 was detected.Tca83 cells were randomly divided into negative control(NC)group transfected with NC plasmid,SOX2 group transfected with SOX2 plasmid,placebo+NC group transfected with NC plasmid and added with placebo,placebo+SOX2 group transfected with SOX2 plasmid and added with placebo,LY294002+SOX2 group transfected with SOX2 plasmid and added with PI3 K inhibitor LY294002.Then the cell migration,the expression of vimentin,E-cadherin,p-PI3 K and p-AKT were detected.Results:The mRNA expression of SOX2 in OSCC was higher than that in normal oral mucosa,and the mRNA expression of SOX2 in Tca83,SCC25 and HN4 cells was higher than that in FM cells,and the increase of SOX2 expression in Tca83 cells was the weakest.Compared with NC group,the migration enhanced,the expression of vimentin,p-PI3 K and p-AKT increased,and the expression of E-cadherin decreased in SOX2 group.Compared with placebo+SOX2 group,the migration weakened,the expression of vimentin,p-PI3 K and p-AKT decreased,and the expression of E-cadherin increased in LY294002+SOX2 group.Conclusion:The expression of SOX2 increases in OSCC and overexpression of SOX2 promotes migration and EMT of OSCC cells by activating PI3 K/AKT pathway.
Keyword：
Oral squamous cell carcinoma; SOX2; Migration; Epithelial mesenchymal transition; PI3K/AKT pathway;
口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是临床最常见的口腔癌,主要的治疗方式是手术切除结合辅助放化疗,但治疗预后不佳,复发率及转移率高、生存率低[1,2]。目前,OSCC的发病机制未完全阐明,临床上也缺乏有效的靶向治疗手段。SOX2是重要的干细胞标志基因,在维持干细胞自我更新和多向分化中起重要作用。近些年多项恶性肿瘤的研究发现,SOX2高表达与OSCC、食管癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发病有关[3-6]。上皮间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)在OSCC浸润及转移中起重要作用,OSCC中SOX2表达增加且与EMT存在相关性,提示SOX2可能通过调控EMT参与OSCC的发生发展[3]。但SOX2是否直接参与OSCC迁移及EMT的调控尚不清楚。因此,本研究将以OSCC细胞为对象,观察分析过表达SOX对细胞迁移及EMT的调控作用及机制。
材料和方法
1 临床样本
收集2017年1月～2019年12月期间我院手术切除的80例OSCC样本,均经术后病理诊断为OSCC且术前均为接受过放化疗;其中男48例,女32例,年龄45～71岁,平均(59.62±10.82)岁。另取同期因外伤进行手术的25例患者,收集正常口腔黏膜组织作为对照组;其中男14例,女11例,年龄40～65岁,平均(57.37±11.24)岁。OSCC患者和对照组患者一般资料比较无显著性差异(P>0.05)。
2 细胞株
OSCC细胞株Tca83、SCC25、HN4与正常口腔上皮细胞株FM购自上海子实生物科技有限公司。
3 实验试剂
SOX2质粒、阴性对照(negative control,NC)质粒(上海生工公司,中国);PI3K抑制剂LY294002(MCE公司,美国);总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒(北京天根公司,中国);RIPA裂解液、BCA法试剂盒(上海碧云天公司,中国;SOX2、N-cadherin、Vimentin一抗(Abcam公司,美国);p-PI3K、p-AKT一抗(CST公司,美国)。
4 细胞培养及分组
Tca83、SCC25、HN4、FM细胞用含有10%胎牛血清的培养基进行贴壁培养,待细胞贴壁生长至密度80%～90%时用0.25%的胰蛋白酶进行消化,按照1:3的比例进行传代,接种在培养板内并分组干预,方法如下:NC组转染NC质粒,SOX2组转染SOX2质粒、安慰剂+NC组转染NC质粒并加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、安慰剂+SOX2组转染SOX2质粒并加入DMSO、LY294002+SOX2组转染SOX2质粒并加入LY294002,每组共处理48 h。
5 mRNA表达的荧光定量PCR检测
取OSCC组织、正常口腔黏膜组织及Tca83、SCC25、HN4、FM细胞,采用总RNA提取试剂盒提取组织及细胞中的RNA,采用cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA,采用荧光定量PCR检测试剂盒配置PCR反应体系,分别扩增SOX2和β-actin,得到扩增曲线及循环阈值后,以β-actin为内参、计算SOX2的mRNA表达水平。
6 蛋白表达的Western Blot检测
将消化后的1×105/个Tca83细胞接种在12孔板,待细胞融合至90%后按照上述方法进行转染和给药,48 h收集细胞并用RIPA裂解液提取蛋白,用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定蛋白含量后,取20 μg蛋白样本进行Western Blot检测,电泳分离蛋白后电转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,5%脱脂牛奶封闭PVDF膜2 h,4℃孵育1:1 000稀释的SOX2、N-cadherin、Vimentin、p-PI3K、p-AKT一抗过夜,洗膜3次后孵育1:2 000稀释的二抗1 h,再次洗膜2次,电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)曝光并计算蛋白条带灰度值。
7 细胞迁移的划痕实验
将消化后的5×105/个Tca83细胞接种在6孔板,待细胞融合至90%后用200 μL枪头在培养板中央作一划痕,而后按照上述方法进行转染和给药,0 h和48 h分别拍照记录并计算划痕面积A0和A48,按照公式(A0-A24)/A0计算相对愈合面积。
8 统计学方法
采用SPSS 21.0软件录入数据并进行统计分析,计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,两组间比较采用配对t检验,3组间比较采用单因素方差分析、两两比较采用LSD-t检验;P<0.05为差异有统计学意义。
结 果
1 OSCC组织和正常口腔黏膜组织中SOX2表达的比较
与正常口腔黏膜组织比较,OSCC组织中SOX2的mRNA表达水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。
2 OSCC细胞株Tca83、SCC25、HN4与正常口腔上皮细胞株FM中SOX2表达的比较
与FM细胞比较,Tca83、SCC25、HN4细胞中SOX2的mRNA表达水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)(图2);其中,Tca83细胞中SOX2表达增加的幅度最小,选择该细胞株用于SOX2过表达及生物学作用的实验。
3 SOX2质粒的转染效率
与NC组比较,SOX2组Tca83细胞中SOX2的mRNA表达水平及蛋白表达水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。
图1 OSCC组织和正常口腔黏膜组织中SOX2表达的比较
图2 Tca83、SCC25、HN4、FM细胞株中SOX2表达的比较
图3 NC组与SOX2组Tca83细胞中SOX2表达的比较
4 过表达SOX2对Tca83细胞迁移及EMT标志基因表达的影响
与NC组比较,SOX2组的相对愈合面积及Vimentin的表达水平明显增加,E-cadherin的表达水平明显减少(P<0.05)(图4,表1)。
图4 过表达SOX2对Tca83细胞迁移及EMT表达基因表达的影响
图4 过表达SOX2对Tca83细胞迁移及EMT表达基因表达的影响
表1 过表达SOX2对Tca83细胞迁移及EMT表达基因表达的影响 (x¯±s)
5 过表达SOX2对Tca83细胞中PI3K/AKT信号通路的影响
与NC组比较,SOX2组p-PI3K、p-AKT的表达水平明显增加(P<0.05)(图5,表2)。
5 过表达SOX2对Tca83细胞中PI3K/AKT信号通路的影响
与NC组比较,SOX2组p-PI3K、p-AKT的表达水平明显增加(P<0.05)(图5,表2)。
6 LY294002对SOX2调节Tca83细胞迁移及EMT基因表达的影响
与安慰剂+NC组比较,安慰剂+SOX2组相对愈合面积、N-cadherin表达水平明显增加,E-cadherin表达水平明显降低(P<0.05);与安慰剂+SOX2组比较,LY294002+SOX2组相对愈合面积、N-cadherin表达水平明显降低,E-cadherin表达水平明显增加(P<0.05)(图6,表3)。
图6 LY294002对SOX2调节Tca83细胞迁移及EMT基因表达的影响
图6 LY294002对SOX2调节Tca83细胞迁移及EMT基因表达的影响
表3 LY294002对SOX2调节Tca83细胞迁移及EMT基因表达的影响 (x¯±s)
讨 论
OSCC容易早期发生浸润和转移,整体预后较差,但具体的发病机制并不明确。干细胞标志基因SOX2的促癌作用在近些年受到越来越多关注,SOX2在多种恶性肿瘤组织中的表达均明显增加[3-6]。徐飞等[3]研究发现,OSCC中SOX2的表达明显增加且随着OSCC组织分型的降低、SOX2表达明显增加,表明SOX2高表达可能参与OSCC的发生及病理特征的恶化。本研究对OSCC中SOX2 mRNA表达水平的分析结果与徐飞的研究一致,进一步在3种OSCC细胞株中验证SOX2的表达可知,与正常口腔上皮细胞株FM比较,3种OSCC细胞株中SOX2的mRNA表达水平均明显增加,与SOX2在OSCC组织样本中的变化一致。
目前,SOX2对OSCC的调控作用尚不十分明确。OSCC中高表达的SOX2与EMT存在相关性[3],SOX2与上皮标志基因E-cadherin呈负相关、与N-cadherin呈正相关,提示SOX2可能在OSCC的发病过程中促进EMT。EMT是上皮表型向间质表型转化的过程,EMT的增强能够使细胞间极性减弱、细胞运动迁移能力增强,对包括OSCC在内多种恶性肿瘤的浸润和转移均具有促进作用[7-9]。SOX2相关的基础研究表明,SOX2对基底细胞癌、舌癌的迁移及EMT具有促进作用[10,11]。本研究已经观察到3种OSCC细胞中SOX2表达增加,选择SOX2表达增加幅度最弱的Tca83细胞验证SOX2对OSCC细胞迁移及EMT的调节作用。
本研究采用转染质粒的方式增加SOX2的表达,与转染NC质粒的Tca83细胞比较,转染SOX2质粒的细胞中SOX2的mRNA及蛋白水平均明显增加,表明转染质粒引起了Tca83细胞中SOX2过表达。在过表达SOX2后,通过划痕实验观察细胞的迁移,SOX2组的划痕愈合面积明显增加,表明SOX2对OSCC细胞的迁移具有促进作用。通过检测EMT标志基因来观察细胞的EMT,SOX2组Vimentin表达明显增加,E-cadherin表达明显减少,表明SOX2对OSCC的EMT具有促进作用,与其促进细胞迁移的作用一致。
在发现过表达SOX2促进OSCC迁移及EMT后,本研究还初步探究了与这一作用相关的分子机制。甲状腺癌相关的研究表明,SOX2的促癌作用与激活PI3K/AKT通路有关[12]。PI3K/AKT是细胞内重要的促增殖、促迁移、促侵袭通路,多项研究已经证实OSCC发病过程中存在该信号通路的过度激活[13,14]。本研究在过表达SOX2后观察到细胞中p-PI3K、p-AKT的表达明显增加,表明SOX2对OSCC中PI3K/AKT通路的激活具有促进作用,进而提示SOX2可能通过激活PI3K/AKT通路发挥促进迁移及EMT的作用。进一步通过使用PI3K抑制剂LY294002来验证PI3K/AKT通路与SOX2促癌作用的关系,加用LY294002后,过表达SOX2促进迁移及EMT的作用均发生逆转。
综上所述,OSCC中SOX2表达增加,过表达通过激活PI3K/AKT通路促进OSCC细胞迁移及EMT,将来SOX2有望成为研究OSCC发病机制及新治疗方式的靶点。
参考文献
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