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zeste基因增强子同源物2抑制剂GSK126对舌鳞状细胞癌细胞增殖与凋亡的影响

来源:搜集整理   日期:2020-10-12 08:33:53点击数:

摘    要:
目的 观察zeste基因增强子同源物2(EZH2)抑制剂GSK126对人舌鳞状细胞癌细胞体外增殖与凋亡的影响,并探讨其相关机制,为舌鳞状细胞癌的临床治疗提供新思路。方法 将不同浓度的GSK126作用于舌鳞状细胞癌CAL-27细胞,通过甲基噻唑基四唑(MTT)、克隆形成、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)荧光染色实验检测药物对细胞增殖能力的影响;采用Hoechst33342荧光染色、JC-1法观察细胞凋亡情况;采用Western blot法检测CAL-27细胞内相关蛋白细胞外调节蛋白激酶(ERK)、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(p-ERK)、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9的表达水平。结果 GSK126能抑制CAL-27细胞增殖并对细胞凋亡有促进作用。GSK126能下调细胞内p-ERK、Bcl-2的表达水平,同时可增加Bax、Cleaved caspase-9的表达(P<0.05)。结论 GSK126可抑制舌鳞状细胞癌CAL-27细胞的增殖,并且能促进其凋亡,其机制可能与抑制MEK/ERK信号通路以及激活Bax/Bcl-2通路有关。
 
关键词:
舌鳞状细胞癌; GSK126; 增殖; 凋亡;
头颈部癌症是全球第八大常见癌症。口腔鳞状细胞癌在口腔癌中发病率最高,其中发生在舌部最为多见。2018年,全世界约有345 900例口腔癌新病例,17.74万人死于口腔癌[1],且近年来,发病年龄趋向年轻化[2]。以手术为主的综合序列治疗是舌癌的主要治疗方法,但由于舌癌恶性程度较高,且易发生淋巴转移,普通的化疗药物有时难以取得令人满意的治疗效果[3]。因此,探索针对舌鳞状细胞癌的新型治疗药物具有重要意义。
 
果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是多梳蛋白复合体家族的主要成员之一。研究[4,5]显示,在多种肿瘤组织中均可出现EZH2高表达现象。EZH2参与调节组蛋白H3第27位赖氨酸(H3K27)甲基化,在调控基因转录和基因沉默中发挥着重要的作用。GSK126作为一种高度选择性EZH2抑制剂[6],已被证实在前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多种癌症中具有治疗效果[7],但目前在舌癌方面的研究不多。本文旨在观察GSK126对舌鳞癌CAL-27细胞增殖与凋亡的影响,并初步探讨其相关机制。
 
1 材料和方法
1.1 实验材料
人舌鳞状细胞癌细胞株CAL-27(中国生命科学院提供),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMEM培养基(Gibco公司,美国),GSK126(Selleck公司,美国),Hoechst33342试剂(北京索莱宝科技有限公司),5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U)试剂盒(广州锐博生物科技有限公司),JC-1试剂盒(上海爱必信生物科技有限公司),二辛可酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司),细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)抗体、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶(phospho-extracellular regulated protein kinases,p-ERK)抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、Cleaved caspase-9抗体、β­actin抗体(CST公司,美国),电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)试剂(沈阳万类生物科技有限公司)。
 
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
使用含10%FBS和1%双抗(青霉素/链霉素)的DMEM培养基,将人舌癌CAL-27细胞置于5%CO2,37℃恒温环境下培养。细胞传代时使用胰蛋白酶消化贴壁细胞,DMEM终止消化并离心,重悬后接种于培养皿中。
 
1.2.2 药物干预
将GSK126用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO)溶解后放置于-80℃保存,实验时各给药组按照不同浓度对储存液进行稀释,溶剂对照组加入相同体积的DMSO。
 
1.2.3 甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)实验
取处于对数生长期的细胞,消化离心后将细胞密度调整为每孔5×103个,均匀铺于96孔板中。设置5个复孔,边缘孔使用无菌PBS补充。细胞贴壁后加入浓度梯度的GSK126(1、2.5、5、10、15μmol·L-1),空白对照组不加药(0μmol·L-1),溶剂对照组加入相同体积的DMSO,继续培养48 h后向每孔加入20μL MTT溶液,孵育3 h后吸弃上清,加入150μL DMSO,低速震荡使结晶充分溶解。最后用酶标仪测定各孔在490 nm处的光密度(optical density,OD)值,计算细胞存活率=(实验组OD值/空白对照组OD值)×100%。
 
1.2.4 克隆形成实验
将对数生长期的CAL-27细胞消化,离心,重悬后接种于六孔板中,细胞密度设为每孔1 000个。待细胞贴壁且生长良好时按不同的浓度(5、10μmol·L-1)给予药物处理,对照组加入同等体积的DMSO,继续培养10 d后吸弃上清,使用4%多聚甲醛室温固定30 min,再加入结晶紫染色,20 min后用PBS洗涤2次,拍照记录实验结果并计算每孔中的细胞群落数,克隆形成率=(克隆数/接种细胞数)×100%。
 
1.2.5 Ed U增殖成像检测
将对数生长期的CAL-27细胞以细胞密度为每孔3×104个接种于3个共聚焦皿中,培养至正常生长阶段,药物处理浓度分别为5、10μmol·L-1,对照组用等体积DMSO进行处理,培养48 h后更换细胞培养液为含Ed U的培养基,孵育2 h,吸弃培养基,用4%多聚甲醛进行细胞固定化处理,用2 mg·m L-1甘氨酸脱色,加入渗透剂(0.5%Triton-100)后行Apollo染色,避光室温下摇床孵育30 min,用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染料染核,使用共聚焦显微镜拍照并记录每个视野内的阳性细胞数目。细胞增殖率=(Ed U阳性细胞数/DAPI阳性细胞数)×100%。
 
1.2.6 Hoechst33342染色
实验收集处于对数生长期的CAL-27细胞并按照细胞密度为每孔5×104个均匀接种于3个小培养皿内,细胞贴壁且生长良好时分别加入浓度梯度为5、10μmol·L-1的GSK126,并设置DMSO溶剂对照组,继续培养48 h后,向每个培养皿中加入Hoechst33342工作液充分覆盖细胞,37℃恒温孵箱内孵育20 min,置于荧光显微镜下观察,拍照并记录实验结果。
 
1.2.7 JC-1染色实验
将CAL-27细胞按照细胞密度为每孔3×104个均匀接种在3个共聚焦皿中,细胞贴壁后分别加入5、10μmol·L-1的GSK126,溶剂对照组不加药,培养48 h后吸去培养液,PBS洗涤1次,加入1 m L培养液及配置好的JC-1工作液,充分混匀,37℃孵育20 min,孵育结束后吸除上清,用JC-1染色缓冲液洗涤2次,加入培养液并放置于共聚焦显微镜下观察红/绿荧光比例,拍照记录实验结果。
 
1.2.8 Western blot实验
收集经不同浓度GSK126处理后的舌癌细胞,加入蛋白裂解液置于冰上充分裂解,离心后取上清使用BCA蛋白定量法定量,测定蛋白浓度并制样。配置凝胶进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacry lamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)电泳,聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜转膜,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封闭2 h后,分别加入ERK、p-ERK、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-9兔抗人一抗及β­actin鼠抗人一抗,4℃过夜,TBST洗膜3次后加入HRP标记的二抗,室温孵育2 h后再次洗膜,ECL显色。
 
1.3 统计学分析
采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析,各组细胞存活率、增殖率及克隆形成率均以均数±标准差表示,多组之间比较使用单因素方差分析,两两比较使用t检验,P<0.05表示差异具有统计学意义。
 
2 结果
2.1 GSK126可抑制CAL-27细胞增殖
MTT实验结果表明,随着GSK126药物浓度变化(0、1、2.5、5、10、15μmol·L-1),细胞存活率分别为100.00%±0.00%、88.13%±4.16%、83.76%±4.16%、53.73%±2.21%、31.47%±2.76%、13.11%±0.85%,细胞存活率随着药物浓度增加而持续下降(图1)。与DMSO组相比,GSK126对CAL-27细胞增殖具有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性,差异有统计学意义(P<0.05)。
与DMSO组相比,随着GSK126浓度增加,克隆形成的群落数逐渐减少,其中DMSO组、5μmol·L-1组的克隆形成率分别为55.20%±3.91%、26.30%±2.91%。10μmol·L-1组中肉眼未见有明显的克隆群落形成(图2)。方差分析结果显示,GSK126组和DMSO组间差异有统计学意义(F=244.794,P=0.000)。
Ed U增殖成像检测结果见图3。由图3可见,经5、10μmol·L-1 GSK126处理后,CAL-27细胞的阳性比例明显较DMSO组降低,且呈浓度依赖性。DMSO组、5μmol·L-1、10μmol·L-1组增殖率分别为88.88%±7.87%、30.30%±10.02%、11.25%±13.15%。经方差分析,3组间差异具有统计学意义(F=58.582,P=0.000)。
 
2.2 GSK126可促进CAL-27细胞凋亡
Hoechst33342染色后,DMSO组细胞形态正常,呈均匀淡染蓝色,核膜形态完整;5μmol·L-1组见部分CAL-27细胞形态大小不均,出现碎片化,细胞核呈高亮状态;10μmol·L-1组见细胞荧光强度更高,细胞核固缩、破碎更明显,大部分细胞形态变小且不规则,破裂成碎片状,死细胞明显增多(图4)。
JC-1荧光探针检测结果见图5。DMSO组细胞活性良好,线粒体膜电位较高,JC-1聚集在线粒体基质中产生红色荧光;经不同浓度(5、10μmol·L-1)的GSK126处理后,JC-1不能聚集在线粒体基质中,而是以单体形式存在,呈现出绿色荧光,提示线粒体膜电位较低,细胞可能正在发生早期凋亡。
 
2.3 GSK126影响CAL-27细胞增殖、凋亡的机制分析
Western blot检测结果见图6和表1。与对照组相比,GSK126作用后的CAL-27细胞内,ERK的表达水平无显著性变化(P>0.05),p-ERK表达水平呈降低趋势。Bax、Cleaved caspase-9表达水平升高,Bcl-2的表达水平降低,各条带呈现近似浓度依赖性。经方差分析,差异具有统计学意义(P<0.05)。
 
3 讨论
舌鳞状细胞癌是口腔鳞状细胞癌中最具侵袭性的一种[8]。尽管在过去的30年里,各种治疗方法都取得了进步,但舌鳞状细胞癌患者的总体5年生存率仍不及50%[9]。化疗是舌癌的治疗方法之一,近年来,随着化疗技术的发展及新型化疗药物的问世,人们对于舌癌治疗药物的探索也逐步深入。
研究[10,11]表明,EZH2是多梳抑制复合物PRC2(po lycomb repressive complex 2)的核心亚基,它可特异性催化组蛋白H3上第27位赖氨酸(H3K27)的甲基化,在表观遗传学领域发挥着不可替代的作用,目前已被证实EZH2与多种肿瘤的发生发展过程相关。GSK126是一种以EZH2为靶点的新型竞争性抑制剂[12],其作为一种新型抗癌药物,已处于临床试验阶段[13]。本实验通过MTT、克隆形成、Ed U荧光染色、Hoechst33342荧光染色、JC-1染色、Western blot等一系列的实验方法表明,GSK126可以有效抑制人舌癌CAL-27细胞增殖并促进其凋亡,且呈浓度依赖性。
 
在克隆形成及Ed U染色实验中可见,GSK126作用于舌癌CAL-27细胞后,细胞增殖水平明显下降。研究发现,MEK/ERK通路与肿瘤细胞增殖过程密切相关,此通路能通过层层级联反应将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内[14,15],已经证实在舌鳞癌细胞中存在MEK/ERK过度激活现象[16],因此抑制ERK信号的激活与传导对于抗肿瘤研究具有重要意义。Western blot实验结果证实,GSK126抑制了p-ERK的表达水平,使进入活化状态的ERK减少,这可能与CAL-27细胞增殖率下降有关。
细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程[17],受到多种相关因子的共同调控,线粒体介导的细胞凋亡是其中一条途径。Bax和Bcl-2是参与调控细胞凋亡的一组基因,Bax过表达可促进细胞凋亡,而Bcl-2具有抑制凋亡作用。研究发现,正常情况下,细胞内部的Bax与Bcl-2比例固定,当细胞接收到凋亡信号时,Bax/Bcl-2比值增大,使线粒体膜通透性升高,细胞色素C(Cyt C)得以释放[18,19],进而激活下游Caspase-9,Caspase-3等相关凋亡蛋白,产生级联反应[20]。而当Bcl-2含量增多时,它可与Bax形成异源二聚体,阻碍Bax发挥促凋亡作用[21]。本研究Western blot结果显示,随着GSK126浓度升高,Bax含量升高而Bcl-2含量下降,Bax/Bcl-2比值增大,而Cleaved caspase-9也呈现上升趋势,表明经GSK126处理后,激活了Bax/Bcl-2通路,从而诱导更多的细胞进入了凋亡阶段。
 
综上所述,GSK126作为一种新型EZH2抑制剂,可抑制舌鳞状细胞癌CAL-27细胞的增殖并且促进其凋亡,其机制可能与MEK/ERK通路以及Bax/Bcl-2通路有关,提示GSK126可能成为一种具有前景的新型舌癌治疗药物。然而,舌癌的侵袭与发展过程复杂,GSK126对于舌癌的抑制效果是否还与其他机制有关仍有待进一步研究。
 
利益冲突声明:作者声明本文无利益冲突。
 
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