摘 要：
目的 探讨IL-1β、TNF-α、Bcl-2和Bax在大鼠下腔深静脉血栓形成中的表达调控机制。方法 将大鼠随机分为对照组(control)、下腔静脉血栓模型组(model)、miR-5189-3p抑制剂组(inhibitor)和miR-5189-3p抑制剂阴性对照(inhibitor NC)组,每组10只。24 h后,颈椎脱臼法处死,抽取血样和采集组织;用ELISA检测血样中IL-1β、TNF-α水平;病理学HE染色法观察下腔静脉血栓形态;Western blot检测下腔静脉组织Bcl-2,BAX蛋白的表达。结果 模型组IL-1β和TNF-α含量较对照组显著升高(P<0.05);miR-5189-3p抑制剂组较对照组显著升高(P<0.05);miR-5189-3p抑制剂组较模型组显著升高(P<0.05);miR-5189-3p抑制剂阴性对照较模型组显著降低(P<0.05)。模型组和miR-5189-3p抑制剂组可见红色血栓和混合血栓,血管壁伴炎性细胞浸润,miR-5189-3p抑制剂阴性对照血栓明显机化,有血流再通的征象。模型组Bcl-2/BAX蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05);miR-5189-3p抑制剂组较模型组显著降低(P<0.05);miR-5189-3p抑制剂阴性对照较模型组显著升高(P<0.05)。结论 miR-5189-3p可以通过调节炎性细胞因子和凋亡相关蛋白表达,从而影响下肢深静脉血栓的形成,为后期研究提供了新的思路与基础。
关键词：
深静脉血栓 静脉内皮细胞 Bcl-2 BAX
Inflammatory cytokines and apoptosis related proteins participate in the formation of deep vein thrombosis of lower extremity in rats
FENG Tao LI Jing PAN Jin-qiang ZHENG Dian-yu CHEN Hui Duman BAGODAT GENG Zhong-li
Department of General Surgery, the Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Medical University; Department of Endocrinology, the Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Xinjiang Medical University;
Abstract：
Objective To investigate the expression and regulation mechanism of IL-1β, TNF-α, Bcl-2 and BAX in rats with inferior vena cava thrombosis. Methods The rats were randomly divided into control group, inferior vena cava thrombus model group, mir-5189-3 p inhibitor group and miR-5189-3 p inhibitor NC group. Twenty-four hours later, the animals were killed by cervical vertebrae dislocation, blood samples were taken and tissues were collected; the level of IL-1β and TNF-α in blood samples were detected by ELISA; The morphology of inferior vena cava thrombus was microscopied with HE staining; The expression of Bcl-2 and BAX protein in inferior vena cava was detected by Western blot. Results The level of IL-1β and TNF-α in the model group was significantly higherthan those in the control group(P<0.05); the level of miR-5189-3 p inhibitor group was significantly higher than that in the control group(P<0.05); the level of miR-5189-3 p inhibitor group was significantly higher than that in the model group(P<0.05); the level of miR-5189-3 p inhibitor negative control group was significantly lower than that in the model group(P<0.05). In the model group and miR-5189-3 p inhibitor group, red thrombus and mixed thrombus were found; the vessel showed inflammatory cell infiltration, and thrombus in the negative control group of miR-5189-3 p inhibitor was obviously organized, with signs of blood flow recanalization. Bcl-2/BAX protein level in the model group was significantly lower than that in the control group(P<0.05); miR-5189-3 p inhibitor group was significantly lower than that in the model group(P<0.05); while miR-5189-3 p inhibitor in negative control group was significantly higher than that in the model group(P<0.05). Conclusions miR-5189-3 p can affect the formation of DVT by regulating the expression of inflammatory cytokines and apoptosis related proteins, which provides a new idea and basis for later research.
Keyword：
deep vein thrombosis; vein endothelial cells; Bcl-2; BAX;
深静脉血栓形成(deep vein thrombosis, DVT)是由于静脉内壁细胞损伤,血液异常凝集和血流速率变慢导致外周血管疾病,发病率高,占血管疾病总数的40%左右,同时可以诱导产生一系列严重的并发症和死亡现象[1]。比如有5%～10%的深静脉血栓患者会出现致死性肺动脉栓塞、50%左右的患者会发展成慢性期致残性的血栓后综合征[2]。这两种症状都严重的威胁着患者的生命健康。
深静脉血栓病发部位主要是下肢,在临床上会出现肢体的外在组织形态变化、疼痛、肤色变化等表现。其血栓脱落可引发肺栓塞[3]。炎性因子在下肢DVT形成中起着重要作用[4],参与了下肢血管壁内皮细胞损伤所导致的DVT的形成和发展。微RNAs(miRNAs)是一类长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA序列分子,参与转录后基因表达的调控反应,在维持机体内细胞稳定分化、增殖、凋亡等方面具有及其重要的作用,目前已发现少量miRNAs在 DVT 发病中的作用[5]。本研究预通过检测不同分组内DVT大鼠血清 IL-1β、TNF-α水平和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达,来验证miR-5189-3p在下肢深静脉血栓形成中对相关炎性细胞因子和凋亡相关蛋白的表达调控作用,为后期临床治疗提供新的方向。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物:
SPF级7～8周SD大鼠48只,体质量180～200 g (新疆医科大学动物中心,动物许可证:XJYK-2019-0013)。
1.1.2 实验试剂:
HE染色试剂盒(Solarbio公司);BCA 蛋白浓度测定试剂盒、Bax Polyclonal Antibody和Bcl-2 Polyclonal Antibody(Bioswamp公司);大鼠白介素1β ELISA试剂盒和大鼠肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒 (Cusabio公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物的分组及处理:
将大鼠分为对照组(control);下腔静脉血栓模型组(model),暴露下腔静脉,5-0丝线结扎下腔静脉分支至髂静脉;miR-5189-3p抑制剂组(miR-5189-3p inhibitor),尾静脉注入5 μg/kg miR-5189-3p inhibitor;miR-5189-3p抑制剂阴性对照组(miR-5189-3p inhibitor NC),尾静脉注入5 μg/kg miR-5189-3p抑制剂,每组10只。
1.2.2 静脉血栓组织病理学检查:
用4%多聚甲醛磷酸缓冲液固定下腔静脉血栓组织标本,石蜡包埋、切片,经苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining, HE)染色后在光镜下观察组织病理变化。
1.2.3 ELISA检测炎性因子水平:
分离血浆,按照ELISA试剂说明书检测IL-1β、TNF-α水平。
1.2.4 Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达:
将少量组织块置于1～2 mL匀浆器中球状部位,加400 μL单去污剂裂解液(含PMSF)于匀浆器中进行匀浆,重复碾几次使组织尽量碾碎,裂解30 min后,在4 ℃,12 000 r/min离心5 min,取适当稀释的上清液用 BCA法来测定蛋白浓度,调整蛋白质浓度后用免疫印迹法(Western blot) 检测组织内Bax、Bcl-2的表达, 其步骤大致如下;经过灌胶、加样、电泳、转膜后,将膜装入 5% BSA封闭液,制置室温摇床1 h,加5 mL一抗稀释液 于 4 ℃冰箱过夜。然后加10 mL二抗稀释液(1∶10 000) 置于摇床上1 h,显色,在暗室中压片曝光显影, 结果用 Quantity-one图像软件分析并进行吸光度值扫描,分别计算目的蛋白条带与GAPDH吸光度值比值(%)。
1.3 统计学分析
所有数据采用均数±标准差(x¯±s)表示,利用SPSS 13.0软件进行数据处理,对计量资料进行单因素方差分析,采用LDS法进行两两比较。
2 结果
2.1 静脉血栓组织病理变化
模型组,血栓充满静脉管腔,与静脉管壁未见明显的黏连,无血管内皮细胞脱落,有少量炎性细胞浸润。miR-5189-3p抑制剂组,血栓未见明显机化,与静脉管壁未见明显的黏连,有大量炎性细胞出现,有少量内皮细胞脱落。miR-5189-3p抑制剂阴性对照组,静脉血栓机化,血栓与静脉管壁有明显黏连,肉芽组织出现,有血流再通的征象,可见少许红细胞的存在(图1)。
2.2 ELISA检测大鼠血浆IL-1β、TNF-α含量
模型组IL-1β和TNF-α含量较对照组显著升高(P<0.05),miR-5189-3p抑制剂组较模型组进一步升高(P<0.05);miR-5189-3p抑制剂阴性对照较模型组显著回降(P<0.05),但仍高于对照组(表1,图2)。
2.3 BAX和Bcl-2在下腔静脉组织内的表达情况
模型组Bax蛋白表达较对照组显著升高(P<0.05),miR-5189-3p抑制剂组较模型组进一步升高(P<0.05),miR-5189-3p抑制剂阴性对照较模型组显著回降(P<0.05)。模型组Bcl-2蛋白表达较对照组显著降低(P<0.05),miR-5189-3p抑制剂组较模型组进一步降低(P<0.05),miR-5189-3p抑制剂阴性对照较模型组显著回升(P<0.05)(图3,表2)。
图1 大鼠下腔深静脉血栓组织的病理变化
表1 各组血浆中IL-1β、TNF-α的含量情况
表2 BAX和Bcl-2在静脉组织内的表达情况
图2 各组血浆中IL-1β、TNF-α的含量情况
图3 不同分组组织中Bax、Bcl-2蛋白表达
3 讨论
DVT 是周围血管常见疾病,且近年来发病率呈逐年升高的趋势[6]。已成为第三大危害人类健康的外周血管疾病,随着现代人生活习惯的改变,老年人逐渐增多,外周血管疾病患病率逐年增加[7]。仅美国新增 DVT 患者约 80 万人/年,大约有37%的患者死于肺动脉栓塞。
miRNA主要参与在转录水平上,可以起到抑制靶基因的翻译,在细胞增殖、细胞迁移、血管生成等过程都有参与,在疾病的发生发展过程中发挥作用。目前已有报道,miRNA可以在血栓机化再通发挥着重要作用。miRNA在心血管疾病发生发展中的作用机制和生物学功能[8]。例如miRNA-92a,通过对其进行功能实验阐明,上调miR-92a的会抑制静脉血栓的溶解再通,而下调miR-92a可以促进静脉血栓的溶解再通过程[9]。miR-221可以通过调节PAK 1的表达,起到抑制细胞增殖的作用[10-11]。
IL-1β 和TNF-α是炎性反应早期细胞因子,是机体炎性反应早期的标志物[12]。可以直接作用于血管内皮细胞,对内皮细胞进行破坏,造成功能异常,促局部血栓形成。 因此IL-1β和TNF-α在血栓的形成中发挥重要作用。本次实验结果表明,IL-1β 和TNF-α在不同分组内表达量差异明显,miR-5189-3p对炎性反应因子IL-1β 和TNF-α起到明显的调节作用,抑制miR-5189-3p,可以增加炎性反应因子的表达量,提示miR-5189-3p参与了血栓形成的过程。
BAX和Bcl-2是一类细胞凋亡相关性蛋白。BAX是促进细胞凋亡蛋白,而Bcl-2是抑制细胞凋亡蛋白。通过Bcl-2和BAX的蛋白表达比值可以判断,抑制miR-5189-3p,会明显的促进细胞凋亡;而miR-5189-3p可以有效的抑制细胞凋亡。本次实验结果说明,miR-5189-3p在内皮细胞凋亡过程中,起到抑制作用。病理结果也通过C组和D组的比对说明了,抑制miR-5189-3p会导致血栓机化过程降低,血栓溶解再通周期变长,提示miR-5189-3p参与了血栓形成的过程。
总之,miR-5189-3p尚属于研究较少的miRNA,也是一种较新的miRNA。通过HE染色、Western blot和ELISA实验,说明抑制miR-5189-3p可以降低血栓的机化和溶解再通,促进细胞凋亡,从而导致血栓的形成加剧。进一步说明了miR-5189-3p通过调节炎性细胞因子和凋亡相关蛋白可以起到抑制静脉血栓形成的作用。
参考文献
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