魏思思 邓晓晴 王苋 薛永娴 黄永胜 赵连梅 单保恩
河北医科大学第四医院科研中心 石家庄市疾病控制与预防中心 中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院
摘 要：
目的 探究胃癌高发区分离的幽门螺杆菌(H.pylori-400)对正常胃上皮细胞系GES1细胞蛋白质组的影响。方法 C-13呼气实验阳性患者胃镜下取下胃黏膜,分离、培养并鉴定H.pylori-400。将H.pylori-400与GES1细胞按50∶1的比例共培养,提取细胞RNA,RT-qPCR法检测炎性因子IL-8、IL-1β和TNF-α的mRNA表达。收集共培养细胞蛋白,用高效液相色谱-质谱联用检测蛋白质组的改变,lable-free进行定量分析。选择差异表达蛋白进行GO和KEGG富集分析,并筛选出其中的关键基因(Hub)。结果 在胃癌高发区(河北井陉地区)分离培养并鉴定出H.pylori-400,其能够促进胃上皮细胞GES1的IL-8,IL-1β和TNF-α炎性因子的mRNA表达。GES1感染H.pylori-400后,373个蛋白发生显著变化(|Fold change|≥2),其中143个蛋白降低,230个蛋白升高。这些差异表达蛋白经富集分析后表明,H.pylori-400可能通过调节细胞周期、T细胞免疫活性以及P53通路调节炎性因子分泌,进而导致肿瘤发生。结论 胃癌高发区分离的H.pylori-400能够促进炎性因子表达,通过影响胃上皮细胞GES1蛋白质组而促进肿瘤发生。
关键词：
幽门螺杆菌 胃上皮细胞 炎性因子 蛋白质组分析
Effect of Helicobacter pylori isolated from the high incidence area of gastric cancer on the proteome of gastric epithelial cell line GES1
WEI Si-si DENG Xiao-qing WANG Xian XUE Yong-xian HUANG Yong-sheng ZHAO Lian-mei SHAN Bao-en
Research Center, the Fourth Hospital of Hebei Medical University; Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention; Institute of Basic Medical Sciences CAMS, School of Basic Medicine PUMC;
Abstract：
Objective To investigate the effect of Helicobacter pylori-400 that was isolated from high incidence area of gastric cancer on the proteome of gastric epithelial cell line GES1. Methods The gastric mucosa of patients with positive C-13 breath test was sampled with gastroscope, and H.pylori was isolated. GES1 was co-cultured with H.pylori-400 in the ratio of 1∶50, cellular RNA was extracted,and the mRNA expressions of IL-8, IL-1β and TNF-α were detected by RT-qPCR. Cellular proteins were extracted and analyzed by HPLC-MS, lable-free was used for quantitative analysis. The differentially expressed proteins were selected for enrichment analysis of GO and KEGG, and the hub genes were screened out for further analysis. ResultsH.pylori-400 promoted mRNA expres-sion of IL-8, IL-1β and TNF-α of gastric epithelial cells. HPLC-MS showed that 373 proteins molecules changed(|Fold change|≥2) after GES1 co-cultured with H.pylori-400, among them, 143 proteins molecules decreased and 230 protein molecules increased. GO and KEGG enrichment analysis showed that H.pylori-400 regulated the secretion of inflammatory factors by regulating cell cycle, T cell immune activity and p53 pathway, which may lead to tumor genesis. ConclusionsH.pylori-400 isolated from the high incidence area of gastric cancer can promote the expression of inflammatory factors and promote the tumor genesis by affecting the proteome of GES1 cells.
Keyword：
Helicobacter pylori; gastric epithelial cell; inflammatory factors; proteome;
幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染是胃癌发生的重要危险因素[1]。世界卫生组织(WHO)已将H.pylori归类为“Ⅰ类”致癌因子[2]。胃癌在全球范围内发病率排名第5(5.7%),死亡率排第3(8.2%)[3]。H.pylori还能够引起其他多种消化道疾病,包括胃炎、消化性溃疡病、胃食管反流病和消化不良等[4]。毒力因子cagA(cytotoxin-associa-ted gene A)和vacA(vacuolating cytotoxin A)是H.pylori相关疾病主要决定因素[5]。研究表明,慢性炎性反应被认为是癌的标志,免疫细胞的异常激活和炎性细胞因子的过度分泌促进胃癌的发展[6]。H.pylori可直接导致DNA双链断裂,并通过刺激产生间接导致DNA损伤的活性氧和活性氮[7]。因此,本研究分离了胃癌高发区H.pylori菌株,旨在通过研究高致病性H.pylori对GES1细胞系蛋白质组的影响,进一步阐明H.pylori诱导胃癌的具体机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 细胞系:
人永生化胃上皮细胞系GES1(北京肿瘤防治研究所柯杨教授课题组惠赠)。
1.1.2 试剂及试剂盒:
胎牛血清(BI),1640培养基(Gibco公司),Trizol试剂、反转录酶和SYBR Green PCR Kit(Promega公司),RIPA裂解液(Thermo Fisher Scientific公司)。
1.2 方法
1.2.1 GES1细胞和H.pylori的培养:
GES1细胞在含有10%胎牛血清的1640培养基中,37 ℃、5% CO2条件下培养。
河北省胃癌高发区井陉县用C-13呼气实验鉴定阳性患者,胃镜下取胃黏膜,彻底研磨后接种在Karmali血平板上,37 ℃、微需氧(CO2 10%、O2 5%、N2 85%)条件下培养3～4 d,纯化出单个菌落后,并对基因型进行鉴定,命名为H.pylori-400。H.pylori-400以MOI=50的比例与GES1细胞共培养48 h。
1.2.2 RT-qPCR:
GES1细胞与H.pylori-400共培养48 h后,加入Trizol试剂提取总RNA。用MMLV反转录酶反转为cDNA。用SYBR Green PCR Kit进行q-PCR反应。引物为IL-8: 上游引物5′-TACTCC AAACCTTTCCACCC-3′,下游引物 5′-CCTACAACAG ACCCACACAAT-3′; IL-1β:上游引物5′-AGCTAC GAATCTCCGACCAC-3′, 下游引物 5′CGTTATCC CATGTGTCGAAGAA3′; TNF-α:上游引物 5′-TTTCC GTGAAAACGGAGCTG-3′, 下游引物 5′-CACCCAC AAGAAGAGGCAGAT-3′。基因相对表达水平用2-ΔΔCt方法测定。
1.2.3 蛋白的提取和消化
GES1细胞与H.pylori-400共培养48 h后,用细胞刮刮下细胞,3 000 r/min,离心5 min,收集细胞沉淀,加入RIPA裂解30 min,超声6次,95 ℃ 2 min使蛋白变性,12 000 r/min,离心10 min去除细胞碎片,收集蛋白上清液进行蛋白质组学实验,BCA定量检测蛋白浓度。
用FASP酶解消化蛋白(filter-aided sample preparation)。取150 μg蛋白加入10 k超滤管中离心浓缩;用含50 mmol/L DTT 的300 μL UA缓冲液(8 mol/L尿素,0.1 mol/L Tris-HCl, pH 8.5)37 ℃孵育 30 min打开二硫键;用含50 mmol/L IAA的300 μL UA缓冲液暗处反应30 min进行烷基化;300 μL UA缓冲液置换3次,300 μL 50 mmol/L NH4HCO3置换2次;加入胰蛋白酶1∶100 (w/w) 37 ℃消化18 h。消化完成后,离心洗脱肽段,用自制C18小柱脱盐,冻干后用0.1% FA溶解,最后肽段定量后进行质谱检测。
1.2.4 高效液相色谱-质谱联用技术检测蛋白质组:
用液-质联用技术对H.pylori处理过的GSE1细胞蛋白质组进行分析,每个反应上样量为1 μg肽段。高效液相色谱分析用HPLC Easy-nLC 1200(Thermo Fisher Scientific公司),流速为300 nL/min。缓冲液 A 为0.1% FA缓冲液,缓冲液B为0.1% FA的80% ACN。液相梯度设置如下:2%～8%缓冲液 B 1 min; 8%～28%缓冲液 B 60 min; 28%～37%缓冲液B 14 min; 37%～100%缓冲液B 5 min; 100%缓冲液B 10 min。蛋白质组学分析采用Q Exactive HF质谱仪 (Thermo Fisher Scientific公司),设置为阳离子模式,喷雾电压2.1 kV,离子传输管温度为320 ℃,Xcalibur软件进行数据依赖性采集。MS1设置为分辨率60 000,AGC target 3e6, maximum IT 20 ms,选择top 20进行MS2,分辨率为15 000,AGC target 1e5,maximum IT 45 ms。其他设置为fixed first mass 110.0 m/z,isolation window 1.6 m/z,NCE 27%,dynamic exclusion time 45 ms。
1.2.5 质谱数据分析:
所有原始数据采用PD2.2软件进行lable-free定量分析,鉴定数据库为Uniprot上下载的human FASTA文件。按照abundance ratio≥2或≤0.5的标准选择差异表达蛋白。用在线软件enrich.shbio.com进行KEGG通路分析, Cytoscope的ClueGo插件进行GO富集分析。
1.3 统计学分析
所有数据使用SPSS 21软件统计分析。计量资料以均数±标准差(x¯±s)表示,两组间比较采用两独立样本t检验。
2 结果
2.1 分离、培养并鉴定胃癌高发区H.pylori-400
分离出胃癌高发区的幽门螺杆菌临床菌株后,革兰染色下可以看到螺旋状、S型和海鸥状等不规则的革兰阴性弯曲杆菌(图1);胃幽门螺杆菌检测试剂盒显示,尿素酶实验阳性。因此,初步鉴定为幽门螺杆菌。
图1 革兰染色鉴定幽门螺杆菌
进而,飞行时间质谱技术和16S rRNA测序方法证实为幽门螺杆菌。其基因型为CagA(+)、VacA(s1a、s2、m1b、i1)、iceA1、cagE2,并将其命名为H.pylori-400。
2.2 H.pylori-400对GES1细胞炎性因子表达的影响
与对照组相比,GES1细胞加入H.pylori-400后,细胞内IL-8、IL-1β和TNF-α的表达水平均显著升高(P<0.05)(图2)。
图2 H.pylori-400感染GES1细胞后对炎性因子表达的影响
2.3 Lable-free定量质谱分析
高效液相色谱联合质谱共鉴定出3 959个蛋白,差异表达蛋白为665,如图3A火山图所示。将这些差异表达蛋白进行分析,筛选出蛋白FDR可信度高,且在每个样品中表达丰度都高的差异表达蛋白,共373个蛋白,其中143个蛋白降低,230个蛋白升高,热图分析如图3B。
图3 质谱分析筛选H.pylori-400感染GES1细胞后的差异表达蛋白
2.4 差异蛋白富集分析
用Cytoscape的ClueGo软件对差异表达蛋白进行GO富集分析,在线软件enrich.shbio.com进行KEGG通路分析,这些通路包含细胞周期调节、周期依赖蛋白激酶活性调控、T细胞免疫活性和细胞组分重组等(图4A, B)。
图4 差异表达蛋白的GO富集分析(A)和KEGG通路分析(B)
2.5 Hub基因选择及与预后的关系
通过String和Cytoscape的cytohubba插件联合找出差异表达蛋白的蛋白相互作用(PPI)网络的前10位关键基因(hub)(图5A,B)。其中ALB、RPL9、CASP3、WDR12、BOP1、POLR1A和EIF4A1在H.pylori-400感染的GES1细胞中表达升高(表1),在the human protein atlas网站上预测hub基因与生存的关系,发现蛋白高表达与胃癌、肝癌和肾癌生存呈显著负相关(图5C)。
图5 差异表达蛋白的PPI中排名前10的关键基因(Hub)(A,B)及其与肿瘤预后的关系(C)
表1 质谱分析Hub基因的表达
3 讨论
H.pylori是已知的胃癌的最强危险因素,因此,本研究分离了胃癌高发区的H.pylori-400,检测了基因型,进一步用质谱技术检测了H.pylori-400导致的正常胃上皮细胞GES1蛋白质组的改变,初步探索该病原体引发胃癌的具体机制。
H.pylori的致病因子包括vacA、cagA、babA、hopQ、oipA和homA/B,其中,cagA和vacA是主要的毒力因子,vacA能够促进胃上皮细胞空泡化,并启动细胞凋亡[8],cagA参与胃癌前病变,促进黏膜炎性反应和细胞增殖[9]。本研究中,临床菌株H.pylori-400的基因型为vacA(s1a、s2、m1、i1),cagA阳性,明确其致病机制则更有意义。
胃癌的发病机制为慢性炎性反应,继而形成慢性非萎缩性胃炎,慢性萎缩性胃炎,肠化生,异型增生,最终形成胃腺癌。多种炎性因子参与H.pylori感染相关胃癌的发生及进展。比如, H.pylori感染能够诱导IL-1升高,IL-1是胃癌进展的主要风险因子[10]。IL-8是一种有效的中性粒细胞趋化因子和激活因子,介导了强烈的促炎反应[11]。肿瘤坏死因子(TNF)是一种参与全身炎性和Th1反应的细胞因子[12]。H.pylori-400感染GES1细胞后,炎性因子IL-8、IL-1β和TNF-α表达升高,表明H.pylori-400能够促进胃上皮炎性反应。
本研究利用HPLC-MS技术筛选出H.pylori-400感染后胃上皮细胞GES1中发生变化的蛋白,进行富集分析后确定了许多典型的信号通路,这些通路通常在H.pylori感染时被激活,比如T细胞介导细胞毒性反应、细胞迁移能力、细胞组分重配、细胞周期蛋白活性及P53信号通路等发生改变,促进肿瘤的发生。对这些网络更透彻的了解将有助于开发有针对性的途径和效应器,以提高临床治疗效益和疾病预防。
此外,本研究在差异表达蛋白的相互作用网络中筛选出了前10位Hub基因,它们与多种肿瘤的预后都显著相关,其中BOP1在人结直肠癌细胞中通过JNK通路促进细胞的迁移和侵袭能力[13]。在哺乳动物细胞中,沉默POLR1A的表达可以稳定抑癌基因P53信号通路[14]。EIF4A1的异常高表达促进胃癌细胞的EMT过程,并且与胃癌预后呈显著负相关[15]。
综上所述,本文利用蛋白质组学方法能够确定胃上皮细胞对H.pylori-400感染的反应,这一技术和方法允许识别和验证新的蛋白靶点,这些靶点在H.pylori诱导的胃癌发生中起重要作用。
参考文献
[1] Baj J,Korona-Glowniak I,Forma A,et al.Mechanisms of the epithelial-mesenchymal transition and tumor microenvironment in Helicobacter pylori-induced Gastric Cancer[J].Cells,2020,9:1055.
[2] Choi IJ,MC Kook,YI Kim,et al.Helicobacter pylori therapy for the prevention of metachronous gastric cancer[J].N Engl J Med,2018,378:1085-1095.
[3] Bray F,Ferlay J,Soerjomataram I,et al.Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].CA Cancer J Clin,2018,68:394-424.
[4] Ferreira RM,Pereira-Marques J,Pinto-Ribeiro I,et al.Gastric microbial community profiling reveals a dysbiotic cancer-associated microbiota[J].Gut,2018,67:226-236.
[5] Bakhti SZ,Latifi-Navid S,Mohammadi S,et al.Relev-ance of Helicobacter pylori vacA 3′-end region polymor-phism to gastric cancer[J].Helicobacter,2016,21:305-316.
[6] Tu S,Bhagat G,Cui G,et al.Overexpression of interleukin-1beta induces gastric inflammation and cancer and mobilizes myeloid-derived suppressor cells in mice[J].Cancer Cell,2008,14:408-419.
[7] Obst B,Wagner S,Sewing KF,et al.Helicobacter pylori causes DNA damage in gastric epithelial cells[J].Carcinogenesis,2000,21:1111-1115.
[8] Yahiro K,Akazawa Y,Nakano M,et al.Helicobacter pylori VacA induces apoptosis by accumulation of connexin 43 in autophagic vesicles via a Rac1/ERK-dependent pathway[J].Cell Death Discov,2015,1:15035.doi:10.1038/cddiscovery.2015.35.
[9] Noto JM,Peek RM.The Helicobacter pylori cag pathogenicity island[J].Methods Mol Biol,2012,921:41-50.
[10] El-Omar EM,Rabkin CS,Gammon MD,et al.Increased risk of noncardia gastric cancer associated with proinflammatory cytokine gene polymorphisms[J].Gastroenterology,2003,124:1193-1201.
[11] Crabtree JE,Farmery SM,Lindley IJ,et al.CagA/cytotoxic strains of Helicobacter pylori and interleukin-8 in gastric epithelial cell lines[J].J Clin Pathol,1994,47:945-950.
[12] Crabtree JE,Shallcross TM,Heatley RV,et al.Mucosal tumour necrosis factor alpha and interleukin-6 in patients with Helicobacter pylori associated gastritis[J].Gut,1991,32:1473-1477.
[13] Chen X,Zhao Y.Block of proliferation 1 promotes cell migration and invasion in human colorectal cancer cells via the JNK pathway[J].J Clin Lab Anal,2020,e23283.doi:10.1002/jcla.23283.
[14] Donati G,Bertoni S,Brighenti E,et al.The balance between rRNA and ribosomal protein synthesis up- and downregulates the tumour suppressor p53 in mammalian cells[J].Oncogene,2011,30:3274-3288.
[15] Gao C,Guo X,Xue A,et al.High intratumoral expression of eIF4A1 promotes epithelial-to-mesenchymal transition and predicts unfavorable prognosis in gastric cancer[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2020,52:310-319.
