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基于网络药理学分析达明饮治疗糖尿病视网膜病变的作用机制研究

来源:搜集整理   日期:2020-12-21   点击数:

  摘    要:
  
  目的 利用网络药理学方法,研究达明饮治疗糖尿病视网膜病变(DR)的药理机制。方法 运用中药系统药理(TCMSP)数据库筛选达明饮生物活性成分及潜在的作用靶点;同时检索GeneCards、OMIM数据库挖掘DR的相关疾病靶基因,对2种靶点进行PPI网络构建,交互得到达明饮治疗DR的关键靶点;采用Cytoscape3.7.1软件绘制达明饮活性成分-DR靶点网络;配合String数据库及Cytoscape3.7.1软件,构建蛋白相互作用(PPI)网络;通过DAVID注释数据库对药物及疾病的靶点进行GO生物学过程、京都基因及基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果 达明饮共包含68个有效活性成分及119个靶点,DR共包含1023个治疗靶点,将药物靶点与疾病靶点相互映射共获取41个共同靶点。PPI蛋白互作网络发现IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3等可能是达明饮治疗DR的核心治疗靶点。通过GO功能分析确定66个相关条目,KEGG富集分析确定113条相关信号通路,主要包括AGE-RAGE信号通路、Apoptosis信号通路、PI3K-Akt信号通路等。结论 达明饮治疗DR是一个“多成分-多靶点-多通路”复杂过程,为进一步研究达明饮治疗DR的物质基础及作用机制提供了理论依据。
  
  关键词:
  
  达明饮 糖尿病视网膜病变 网络药理学 靶点 信号通路
  
  糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病引起的微血管病变之一[1]。目前已成为全世界中青年人群主要致盲原因[2]。血糖的持续升高,引起体内血糖代谢发生紊乱,导致多元醇通路及氧化应激反应等出现异常,是本病的主要致病因素[3]。西医用于治疗DR的药物有限,多在控制血糖的基础上,使用羟苯磺酸钙、蛋白激酶C阻断剂、糖皮质激素、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂等。糖皮质激素虽可抑制VEGF过度表达,紧凑毛细血管内皮细胞,调节血视网膜屏障,但长时间激素治疗会带来诸多不良反应,如眼内压增高、白色晶状体形成及炎症等;蛋白激酶C阻断剂可有效阻断VEGF受体,但会出现恶心、腹泻症状[4]。中医药疗法在治疗DR方面优势明显,通过辨证论治,因方施药,效果明显,已逐步成为防治DR进展不可或缺的重要组成部分[5]。
  
  达明饮是黑龙江中医药大学孙河教授自拟方剂,主要由三七、蒲黄、黄精、黄芪、川芎、女贞子等组成[6]。方中三七味微苦、甘,性温,归胃、肝经,活血定痛化瘀;蒲黄味甘,性平,归肝、心包经,功效为止血、化瘀;黄精性平,味甘,归脾、肺、肾经,具有补气养阴、润肺、健脾、益肾之功;黄芪味甘,性微温,归脾、肺经,补气固表;川芎性温,味辛,归肝、胆、心包经,活血行气效果显著,且能疏通上述诸药之药性;女贞子性平,味甘、苦,归肝、肾二经,有补益肝肾、清热明目等功效,同时具有降低血糖的作用;诸药合用,共奏益气养阴,活血化瘀,通络明目之功,可改善视功能。
  
  现代药理研究[7]表明,达明饮可通过降低血液黏稠度、扩张眼底血管、增加血流量、改善视网膜血供,达到防护视网膜及眼底血管的目的。由于DR的病理机制复杂,且达明饮作为自拟方剂,药效物质基础及药理机制尚不明确,故系统地研究达明饮治疗DR的生物活性成分和分子作用机制,有利于为临床用药提供依据。网络药理学基于系统生物学理论,通过建立药物与相关靶点、疾病与治疗靶点间的关系进行模型预测,整合两者的作用网络,分析药物在各网络模块中与特定节点间的联系,系统、整体地探究相关药物与潜在靶点间的关系[8]。本文基于网络药理学,对达明饮进行科学的阐释,为临床推广本方提供科学依据。
  
  1 材料与方法
  
  1.1 化学成分检索
  
  通过TCMSP数据库,分别以“三七”“蒲黄”“黄精”“黄芪”“川芎”“女贞子”作为检索词,查找各中药的化学成分。选取同时满足口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30.00%且类药性(drug like,DL)≥0.18作为筛选条件。
  
  1.2 药物靶点预测
  
  基于TCMSP数据库,将达明饮的有效化合成分依次匹配潜在的靶点基因;同时,结合蛋白质数据库获取与所选化合物相关的蛋白靶点,使用TCMSP数据库进行相关靶点的筛选。
  
  1.3 确定DR的相关靶点
  
  从Gene Cards数据库和OMIM数据库中以“diabetic retinopathy”作为关键词检索与DR相关的疾病靶基因。建立Excel表格,将相关靶点基因依次录入,并以此作为分析达明饮中药活性成分治疗DR的潜在作用靶点。
  
  1.4 构建化合物活性成分-作用靶点网络
  
  将达明饮中有效活性成分与治疗DR的作用靶点同时导入Cytoscape3.7.1软件,构建活性成分-作用靶点网络。
  
  1.5 核心靶点相互作用网络的构建与分析
  
  将达明饮治疗DR的潜在靶基因导入String数据库,并限定物种为“Homo sapiens”,检索得到靶标-蛋白相互作用关系,以TSV格式进行保存。将TSV文件再次导入Cytoscape3.7.1软件,用Network Analyzer工具进行网络分析,获取Degree值。通过Cytoscape3.7.1软件绘制蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络,将所绘制的PPI网络图保存为“.png”格式图片。
  
  1.6 生物学过程及通路分析
  
  将达明饮中各中药成分靶点基因Uniprotkb导入DAVID数据库,形成基因列表,对该表进行基因功能国际标准分类体系(gene ontology,GO)分析及京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析。选取错误发现率(false discovery rate,FDR)值<0.05的通路,使用Omic Share网站绘制气泡图。
  
  2 结果
  
  2.1 达明饮活性化合成分与靶点
  
  共检索获取三七化学成分119个、蒲黄化学成分33个、黄精化学成分38个、黄芪化学成分87个、川芎化学成分189个、女贞子化学成分119个。以OB≥30.00%且类药性DL≥0.18作为限定,筛选出符合条件的活性成分三七8个、蒲黄8个、黄精12个、黄芪20个、川芎7个、女贞子13个,选择OB值排名靠前的5位化合成分进行数据展示(表1)。
  
  表1 达明饮活性成分
  
  表1 达明饮活性成分
  
  2.2 靶点预测
  
  在Uniprot数据库中输入相应靶蛋白,获取119个靶点相应基因。将获取的靶基因与Gene Cards和OMIM数据库中检索得到的有关DR的相关基因进行比对,筛查出可能与DR相关的靶点,共41个(表2)。
  
  2.3 活性成分-靶点网络
  
  本网络共有288个节点,化合物节点250个,靶点节点38个、543条边,达明饮复方中Degree值排名前6的主要化合物为槲皮素、山奈酚、黄芩素、木犀草素、薯蓣皂素、β-谷甾醇;每条边都代表着化合物与靶点之间的直接联系;不同靶点可能对应相同活性成分,单一靶点也可与不同活性成分相对应(图1)。
  
  2.4 核心靶点相互作用网络
  
  将2个数据库所获得的DR靶点进行交集,再与达明饮的中药有效活性成分的作用靶点进行交集处理,最终获得达明饮治疗DR的关键靶点41个(图2)。将41个潜在靶点输入String数据库,限定物种为“Homo sapiens”,获取蛋白相互作用关系,使用Cytoscape3.7.1软件绘制相互作用网络。如图可见,本网络共包含41个节点,208条边。图中节点表示蛋白,边则表示蛋白之间的关联性。Degree值排名靠前的蛋白,依次为IL6、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR、ESR1(图3)。
  
  2.5 GO功能富集分析
  
  通过DAVID注释平台对达明饮PPI网络中靶点蛋白在基因功能的作用下进行分析,并筛选出基因数10个以上者,分别为生物学过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)(图4)。其中BP包括转录因子活性、直接配体调节序列特异性DNA结合、类固醇激素受体等;CC包括酶激活剂活性、核受体活性等;MF包括DNA结合转录激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特异性、蛋白质异二聚化活性(表3)。
  
  2.6 KEGG通路富集分析
  
  通过DAVID数据平台进行KEGG通路富集分析,对达明饮PPI网络中蛋白在信号通路中的作用进行相应分析,共得到113条信号通路,依据P<0.05且FDR<0.05,筛选出10条主要作用的信号通路。包括凋亡信号通路、磷酯酰肌醇-3-激酶-丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、丝裂原活化蛋白激酶信号通路、低氧诱导-1信号通路、JAK-STAT信号通路、Ras信号通路、NF-KB信号通路、血管内皮生长因子信号通路(图5,表4)。
  
  表2 靶点预测信息
  
  表2 靶点预测信息
  
  图1 达明饮化合物-靶点网络图
  
  图1 达明饮化合物-靶点网络图
  
  注:黄色代表疾病,蓝色代表药物,橙色代表活性成分,绿色代表PPI蛋白,节点大小与度值成正比;DR糖尿病视网膜病变;huangqi黄芪;sanqi三七;puhaung蒲黄;chuanxiong川芎;huangjing黄精;nvzhenzi女贞子
  
  表3“达明饮-DR”GO生物过程分析
  
  表3“达明饮-DR”GO生物过程分析
  
  图2 达明饮-DR VENN网络图
  
  图2 达明饮-DR VENN网络图
  
  注:DMD达明饮;DR糖尿病视网膜病变
  
  图3 达明饮-DR PPI网络可视化图
  
  图3 达明饮-DR PPI网络可视化图
  
  图4 达明饮治疗DR潜在靶点的GO功能分析气泡图
  
  图4 达明饮治疗DR潜在靶点的GO功能分析气泡图
  
  图5 达明饮治疗DR潜在靶点的KEGG靶点通路柱状图
  
  图5 达明饮治疗DR潜在靶点的KEGG靶点通路柱状图
  
  表4 达明饮KEGG靶点通路富集结果
  
  表4 达明饮KEGG靶点通路富集结果
  
  3 讨论
  
  中医将DR归属于“消渴目病”范畴,久病致肝肾亏虚、精血不能上承于目,发为本病。孙河教授通过多年临床经验总结发现,DR的诱因不外乎出血与瘀血,治疗应抓主要病因病机,结合局部症状,整体辨证施治。本研究是从网络药理学方面分析达明饮治疗DR的分子作用机制,从药物有效成分-疾病-关键靶点网络中发现,达明饮中槲皮素、β-谷甾醇、黄芩素、山奈酚、木犀草素等成分Degree值较高,提示上述药物成分可能与DR治疗密切相关。现已证实,槲皮素具有抗炎和神经保护作用,可通过VEGFR-2受体靶向调节ACP/MTOR/P70S6K通路,抑制体内蛋白激酶C、ERK1/2和细胞溶质C磷酸化,保护血-视网膜屏障免受新生血管的刺激[9-11]。β-谷甾醇具有调节脂质代谢的作用、保护血管内皮细胞、降低血清胆固醇和甘油三酯水平、促进转运及清除、对抗血小板凝集起到保护作用[12]。研究[13-14]发现,黄芩素对DR患者血管通透性具有神经保护作用;此外,黄芩素还可降低DR小鼠视网膜中活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平和NADPH氧化酶2的表达,对DM小鼠的视网膜具有抗炎、抗氧化及抗渗透作用。山奈酚可通过抑制VEGF-2的过表达,延缓眼底新生血管的形成[15-16]。此外,现代研究[17]证实,木犀草素对VEGF诱导的血管生成起到抑制作用,表明木犀草素可抑制视网膜新生血管生成。以上诸多报道均与本研究得到的结果得到相互验证,证明达明饮治疗DR分子机制的科学有效性。
  
  通过分析发现,靶蛋白IL-6、MAPK8、VEGFA、CASP3、EGFR在PPI网络中的Degree值较高,表明达明饮可能通过以上靶蛋白治疗DR。IL-6作为一种炎症细胞因子,主要作用于机体炎症的调节方面[18],研究证实,增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)的发生与免疫应答相关,在PDR患者玻璃体中检测出浓度较高的IL-6;表明炎症免疫过程在PDR中意义重大[19-20]。WU等[21]报道,VEGFA在PDR中具有上调作用,实验证明在PDR小鼠模型中下调VEGFA水平可抑制视网膜中新生血管形成。OTANI等[22]研究发现,肾素-血管紧张素系统与DR新生血管形成有关,通过PKC和MAPK信号途径介导,AngⅡ可刺激视网膜血管内皮细胞生成素m RNA表达。WILSON等[23]报道,MAPK参与细胞外基质的降解,促进DR新生血管形成。KU-MAR等[24]用槲皮素治疗DR大鼠,其体内Caspase-3表达明显下降,提示Caspase-3可通过网膜中的Bdnf-trkb/aktsynaptophysin信号通路发挥潜在的抗凋亡作用,保护视神经损伤。Sebastian等[25]发现EGFR是广泛分布于细胞膜的多功能跨膜糖蛋白,其配体与EGFR结合,可激活调节基本细胞活动的信号通路。PARK等[26]发现,EGFR受体对视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cells,RPE)和Müller细胞的迁移和增殖具有调节作用。由此可见,网络药理学的结果与上述结果相一致,表明达明饮可通过对以上蛋白的相互调节,从而影响DR发生发展全过程。
  
  通过GO富集分析可知,达明饮治疗DR涉及DNA结合转录的激活、RNA聚合酶Ⅱ特异性、蛋白质异二聚化活性、近端启动子序列特异性DNA结合、酶激活剂活性、染色质结合、核受体活性、转录因子活性、直接配体调节的序列特异性DNA结合、类固醇激素受体、酰胺键合等途径。KEGG通路富集分析提示,达明饮的关键靶点基因富集与DR密切相关的通路上,本方主要与Apoptosis、AGE-RAGE、PI3K-Akt等通路有关。Wu等[27]发现,AGE-RAGE信号通路可以激发氧化应激和炎症反应,持续高血糖状态下,刺激RPE细胞、AGE-RAGE信号被激活,导致视网膜视觉微循环功能障碍。Fletcher等[28]发现,DR的发生发展与视网膜毛细血管周细胞、内皮细胞及神经细胞的凋亡有关。汪东生等[29]研究认为,长期处于高糖环境下,视网膜细胞可见NF-κB和Caspase-3活化。由于DR容易产生炎症反应,造成眼底微循环障碍,故达明饮可通过抑制炎症反应发展、改善眼底微循环。
  
  PI3K/Akt信号通路可使视网膜内皮细胞出现增殖、存活,抑制细胞凋亡[30]。DR发生时体内会出现低氧和高血糖,造成VEGF过度表达,通过KDR和FIT-1受体,诱导PI3k/Akt信号通路,加速内皮细胞迁移、增殖,形成微血管腔,导致眼底新生血管形成[31]。Xie等[32]发现,VEGF通过激活下游PI3K/Akt信号级联分子,抑制内皮细胞凋亡,促进内皮细胞增殖和血管新生。Zdychova等[33]认为,PI3K/Akt信号通路对内皮细胞的血管发生、增殖、微血管通透性、存活、细胞转化和胚胎发育发挥重要作用。因此,达明饮可能通过调节视网膜内皮细胞的凋亡途径、抑制新生血管生成,来达到防治DR的作用。
  
  综上所述,通过对达明饮所含化合物、靶点、作用通路等进行GO分析与KEGG分析,初步验证出本方治疗DR的药理机制,为后期进一步研究本方的机制提供有价值的科学参考。
  
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